質(zhì)粒載體的構(gòu)建(編輯修改稿)
2025-07-16 13:42 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 6ul P2a（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul P2b（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul dNTP（） ddH2O 19ul PCR反應(yīng)條件: 94℃ 5min 30 cycles: 94℃ 40s 54℃ 40s 72℃ 2min30s 72℃ 10min 4℃ forever電泳結(jié)果表明:以2管和c管為模板可得到明顯的目的基因條帶,依據(jù)此次電泳結(jié)果,可先后再利用PCR擴(kuò)增（各100ul,每管25ul,共8管） PCR反應(yīng)體系2*100ul（每管25ul,共8管） 模板2 模板c Pyrobest 2ul 2ul buffer（10x） 10ul 10ul 模板 4ul 40ul P2a（10uM） 4ul 4ul P2b（10uM） 4ul 4ul dNTP（） 2ul 2ul ddH2O 74ul 38ulPCR反應(yīng)條件: 94℃ 5min 30 cycles: 94℃ 40s 54℃ 40s 72℃ 2min30s 72℃ 10min 4℃ forever電泳條帶明顯而且明亮,切膠回收保存待用.。 電泳 配膠① 配制適量的電泳及制膠用的緩沖液（1X TAE Buffer）② 根據(jù)制膠量和凝膠濃度，準(zhǔn)確稱量瓊脂糖粉（1g）,加入適當(dāng)?shù)腻F形瓶中。③ 加入一定量的電泳緩沖液（1X TAE Buffer 100ml）。④ 熔化完全，冷卻至600C左右，加入EB57ul，充分混勻。⑤ 將溶液倒入制膠模中，之前應(yīng)在適當(dāng)位置插上梳子。⑥ 室溫下凝固，不立即使用時(shí)，可用保鮮膜將凝膠包好后放40C 保存，一般可保存25天。 電泳 取適量的PCR產(chǎn)物與適量的溴酚藍(lán)混合混勻后加入凝膠槽中，另取適量的DNA Maker 加入右邊槽中，開始電泳。 紫外觀察電泳條帶 當(dāng)溴酚藍(lán)跑到適當(dāng)位置時(shí)，在紫外光下觀察目的基因的電泳條帶（1kb處） 切膠回收目的DNA切膠回收目的DNA的方法步驟： 操作流程見右圖，全套操作約需30分鐘，詳細(xì)說(shuō)明如下。1. 使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2. 在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。注）切膠時(shí)
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