【文章內(nèi)容簡介】 可能調(diào)控棉纖維起始發(fā)育。進一步研究發(fā)現(xiàn)GaMYB2 包含有和bHLH 蛋白互作的保守氨基酸信號，表明該基因和這些蛋白是通過物理互作方式來調(diào)節(jié)纖維細胞命運決定[13]。GhMYB109 是通過同源克隆法從陸地棉(G. hirsutum)得到另外1個R2R3MYB 蛋白基因，該基因在結(jié)構(gòu)上與擬南芥中根毛發(fā)育相關(guān)基因GL1相似，同樣具有Rlike bHLH結(jié)構(gòu)域，在纖維起始細胞和延伸細胞中特異表達，但在延伸纖維中表達量更高，因此推斷該基因可能調(diào)控纖維延伸而不是起始。在陸地棉中分離的另外1 個MYB蛋白基因GhMYB25，它和金魚草中的R2R3MYB 蛋白基因AmMIXTA相似，該基因在早期發(fā)育的長纖維細胞中表達。煙草中過量表達GhMYB25能增加葉表皮毛分支，進一步表明棉纖維和表皮毛發(fā)育有關(guān)聯(lián)[14] Ma P C, Rould M A, Weintraub H, Pabo C O. Crystal structure of MyoD bHLH domainDNA plex: perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation[J].Cell,1994,77: 451459。通過激光捕獲顯微解剖實表明相對于無纖維胚珠表皮細胞，GhMYB25在有纖維起始細胞中富集表達。Loguercio等利用擬南芥基因保守結(jié)構(gòu)域為探針，從陸地棉胚珠cDNA文庫中分離到6個MYB基因，并命名為GhMYB1－GhMYB6。通過RTPCR 分析發(fā)現(xiàn)GhMYB4 和GhMYB6 在胚珠內(nèi)高表達，其中GhMYB6在纖維中表達水平最高。陸地棉中另外2個MYB 基因GhMYB7，GhMYB9 被認為同纖維起始密切相關(guān)，GhMYB7和GhMYB9均在花和纖維部位表達，當(dāng)GhMYB7轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥后，轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥花器官發(fā)生明顯變化，推測該基因可能抑制GA 生物合成或者信號傳導(dǎo)途徑，進而調(diào)節(jié)纖維起始發(fā)育[15] O’kelley J C, Carr P H. Elongation of the cotton fiber[J]. Growth and differentiation in plants, 1953,59(6): 5568。同時，我們以海島棉為研究對象，結(jié)合植物中R2R3MYB 類轉(zhuǎn)錄因子基因的結(jié)構(gòu)特點，采用RACE 技術(shù)，從海棉纖維發(fā)育起始階段(開花前3d)的胚珠組織中成功分離到3個R2R3MYB類基因。通過RTPCR、Realtime PCR、RNA in situ等手段詳細研究了這3個基因的表達模式，結(jié)果表明這些基因在纖維和胚珠外表皮部位顯著表達，同時我們還將這3個基因成功轉(zhuǎn)入擬南芥中，其中GaMYB2 基因能顯著提高擬南芥表皮毛的密度，這些研究為進一步研究MYB 在纖維發(fā)育機理提供重要的分子證據(jù)。棉纖維也屬于植物表皮毛的一種，在擬南芥表皮毛有關(guān)形態(tài)建成、核內(nèi)復(fù)制、分支形成以及伸展方向的基因，均能在棉纖維發(fā)育中找到高度類似的同系物[16] 陳俊, 朱英, cDNA的克隆和表達分析[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報, 2002, 28(4): 267274.[17] 王棟, 李利紅, 陳志玲, 夏桂先. 擬南芥根特異表達轉(zhuǎn)錄因子AtMYB305 的鑒定及功能研究[J]. 科學(xué)通報, 2001, 46(21):18041809。值得一提的是，盡管很多MYB基因在各個時期胚珠部位中均有表達，但并不是所有的MYB基因均在纖維部位特異性表達，它們也可能參與其它代謝調(diào)控植物表皮毛和根毛的發(fā)育是由眾多基因綜合作用結(jié)果，推測棉纖維發(fā)育也是由多種因素綜合調(diào)控的復(fù)雜過程，因此這些同源基因在纖維發(fā)育中的作用只有通過更深入研究才能得到。第2章 目的基因的獲得 材料與方法棉花品種：徐州142。試驗試劑：Marker，大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自北京天根公司，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購OMEGA公司，KOD FX、Target ClonePlus購自東洋紡公司，GhCPC5的cDNA為中棉所保存，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，試驗中所用的引物上海生工合成，測序也由上海生工公司完成。所用的主要設(shè)備有：超凈工作臺、恒溫搖床培養(yǎng)箱、高壓蒸汽消毒鍋、超低溫冰箱、高速冷凍離心機、PCR儀、水浴鍋、真空冷凍干燥器。 試驗方法 目的基因的獲得根據(jù)TOYOBO公司的KOD FX說明書。 PCR的反應(yīng)體系試劑名稱試劑用量buffer25 μLdNTP10 μLKOD酶1 μL引物F(10μM)1 μL引物R(10μM)1 μL模板2 μL滅菌蒸餾水10 μLPCR擴增程序為：94℃ 3 min；(94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 2 min)30；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存[18] Stracke R, Werber M, Weisshaar B. The R2R3MYB gene family in Arabidopsis thaliana.[J] Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4:447456.。對50 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小符合預(yù)期設(shè)計則視為有效結(jié)果，擴增片段即為目的片段。 克隆載體構(gòu)建(1)3’端dA附加反應(yīng) 將9 μL上述產(chǎn)物與1 μL 10Aattachment Mix混勻，于60℃進行反應(yīng)10 min。（2） 連接 ： 克隆載體的連接體系試劑名稱試劑用量2ligation buffer5 μLpAT2載體(50ng/μL)1 μLT4 DNA連接酶1 μLPCR產(chǎn)物X μL滅菌蒸餾水(10X) μLX=50Y247。Z (Ykb：PCR產(chǎn)物的大??；Zng/μL：PCR產(chǎn)物濃度)注意：通常pAT2載體和PCR產(chǎn)物的比例為1:3。(3)將反應(yīng)液于室溫(15～20℃)進行反應(yīng)30 min。(4)轉(zhuǎn)化 將上述的連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，其操作流程如下：取一只感受態(tài)細胞（100 μL），置于冰中融化 向感受態(tài)中加入510μL連接產(chǎn)物，輕輕轉(zhuǎn)動，冰浴30 min42℃水浴60~90 s，再快速移入冰中，靜置2~3 min加入1 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，190 rpm晃動，1 h 4000 rpm，離心5 min，收集菌液、涂板，培養(yǎng)過夜挑取白色菌落 該階段用到培養(yǎng)基的配方 LB培養(yǎng)基(200 mL )LB/Amp培養(yǎng)基(200 mL)LB/Amp/XGal/IPTG平板培養(yǎng)基(200 mL)胰蛋白胨2 g胰蛋白胨2 g 胰蛋白胨 2 g酵母提取物1 g酵母提取物1 g 酵母提取物 1 g氯化鈉2 g氯化鈉2 g 氯化鈉 2 g 瓊脂糖 3 g高溫高壓滅菌，121℃，15 min，冷卻至60℃ 加入200 μL Amp 加入200 μL Amp 加入400 μL XGal 加入200 μL IPTG挑取重組子：在超凈工作臺上用槍頭挑取白色單菌落于含有氨芐的LB培養(yǎng)基( mL的離心管)中，培養(yǎng)5~6 h(37℃,190rpm)。 基因藍白斑篩選結(jié)果(5)重組體確認 以上述菌液為PCR模板，PCR程序和擴增此基因的程序一致。PCR結(jié)束之后進行瓊脂糖凝膠電泳，將經(jīng)PCR驗證正確的菌液送去測序。 結(jié)論與分析PCR擴增凝膠電泳圖如下： CPC5基因片段擴增后的凝膠電泳圖對于基因的擴增，PCR最好不要超過30次循環(huán)數(shù)[19] Ross J A, Kasum C M. Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and