質(zhì)粒dna制備(編輯修改稿)
2024-08-28 14:25 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 1. pBR322 ? pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)為 4 363bp，由 3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來自 pRSF2124， tetr來自 pSCl01，復(fù)制起始點(diǎn)來自 pM9。核苷酸的序次號(hào)，以 EcoRI序列 GAATTC的第一個(gè) T為第一個(gè)核苷酸。 2. pUC系統(tǒng) ? 如 pUCl8和 pUCI9，由 pBR322的 ampr基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分 1acZ基因和一個(gè)多種限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)的接頭構(gòu)成，全長(zhǎng) 2 666bp， pUCl8和 pUCl9所含多位點(diǎn)接頭的方向正好相反。 3．表達(dá)載體 ? 載體含有 tac啟動(dòng)子 、 Lac操縱基因 、SD序列 、 Lac I阻遏蛋白基因等 。 四、質(zhì)粒 DNA的提取和純化 （一）、 質(zhì)粒提取的主要步驟 1．細(xì)菌的培養(yǎng)： ? 先分離單個(gè)菌落， 接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒 DNA也在自主復(fù)制。 ? 對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體 DNA的復(fù)制。質(zhì)粒 DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增。 ? 對(duì)于新一代的質(zhì)粒如 pUC系列等，由于宿主對(duì)這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴(yán)，利用氯霉素對(duì)質(zhì)粒 DNA的選擇性擴(kuò)增并不十分必要。 ? 長(zhǎng)時(shí)間在氯霉素存在下 ， 質(zhì)粒 DNA合成過程中 ， 復(fù)制鏈中會(huì)摻入核糖核苷酸 ， 對(duì)堿性條件敏感 ， 將會(huì)導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNA和線性質(zhì)粒的產(chǎn)生 ． ? 但有些人仍然偏愛用氯霉素選擇性擴(kuò)增質(zhì)粒 ， 其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量 。 而且細(xì)菌量的減少 ， 使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低 ， 操作更方便 、 有效 ， 對(duì)煮沸法更是如此 。 所以使用氯霉素的主要目的 ， 是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下 ， 減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量 ． ? 有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差 ， 常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致 。 ? 這種低效率擴(kuò)增 ， 可利用高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基促進(jìn)生長(zhǎng) ， 一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量 46倍 。 2．細(xì)菌的收集與裂解 ? 細(xì)胞生長(zhǎng)過程中 ， 排出大量代謝產(chǎn)物 ，為了提高質(zhì)粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ，細(xì)菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ，漂洗 l2次 ， 離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈 。 ? 細(xì)胞的裂解方法很多 ， 如去污劑法 ， 沸水熱裂法 、 堿變性法 ， 有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等 。 ? 不同方法各有利弊，一
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