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質(zhì)粒dna制備(已改無錯字)

2022-08-29 14:25:24 本頁面
  

【正文】 般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。 3.質(zhì)粒 DNA純化 ? 質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來以后,為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。 CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。 ? 但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長,近年來,發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法,分級聚乙二醇沉淀法等,也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。 ? 轉(zhuǎn)基因動物,真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及 DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn),對閉合環(huán)狀雙鏈 DNA的要求較高,一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。 ? 對于 DNA片段酶切回收,內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實(shí)驗(yàn),直接用小量或中量提取的 DNA樣品,并不需要超速離心純化,一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。 (二) 質(zhì)粒 DNA的制備 ? 質(zhì)粒 DNA的小量制備 25ml ? 質(zhì)粒 DNA的大量制備 500ml ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? SDS裂解法 ? Triton溶菌酶法 (三)質(zhì)粒 DNA提取方法的選擇 ? 常用的煮沸法 , 堿法 ,SDS法均可獲得較滿意效果 . 至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒 , 用煮沸法或 SDS法進(jìn)行質(zhì)粒 DNA的大量分離 , 只是各個實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問題 . ? 但是對于不同的菌株和不同大小的質(zhì)粒 DNA分子及以后進(jìn)行的不同實(shí)驗(yàn)等具體情況 , 選擇哪種方法制備質(zhì)粒 DNA,應(yīng)考慮以下因素: 1.菌株類型 ? 大量提取 HB101, TGl菌株中的質(zhì)粒 . 不提倡選擇煮沸法 , 這類細(xì)菌富含糖類 , 在煮沸或去污劑裂解細(xì)菌時 , 大量釋放出來 。 ? 若用 CsClEB梯度平衡超速離心 , 糖類的密度平衡區(qū)域與閉環(huán)共價(jià)質(zhì)粒 DNA帶非常鄰近 , 在抽取閉環(huán)質(zhì)粒 DNA時 , 不可避免地污染有糖類 , 它們可抑制許多 DNA限制性內(nèi)切酶的活性 。 ? 另外 , HB101及其它含有 endA+基因型的菌株表達(dá)中的核酸內(nèi)切酶 A, 在煮沸時不能完全失活 , 在以后操作中 ,只要有 Mg2+存在 (如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 ),核酸內(nèi)切酶 A就可將質(zhì)粒 DNA降解 , 而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 。 ? 若一定要用煮沸法提取這類菌株的質(zhì)粒DNA,不管是大量還是小量制備,必須用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次.以去除該酶. 2.質(zhì)粒的大小 ? 大于 15kb的質(zhì)粒 DNA易被強(qiáng)烈的物理或化學(xué)作用損壞 , 所以常選用操作過程較溫和的 S
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