質(zhì)粒dna制備(參考版)
2024-08-12 14:25本頁面
【正文】 這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去 。如果依然存在 ， 可用離心柱層析法純化ＤＮＡ 。 問題： ? １ ） 有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí) ，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割 ， 這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠 。 大部分 DNA和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS的作用下形成沉淀 ， 而 CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài) 。 （四）堿裂解法原理 ： ? 在 ， 線性的大分子量細(xì)菌染色體 DNA變性 ， 而共價(jià)閉環(huán) (CC)質(zhì)粒 DNA仍為自然狀態(tài) 。 4．細(xì)菌的培養(yǎng)與收集 ? 細(xì)菌生長過程中的代謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，也會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量和內(nèi)切酶酶解效果。 ? 1966年 Vinograd等人對這個(gè)問題作過報(bào)道 ， 但目前 ， 仍有些實(shí)驗(yàn)人員 ， 對這一關(guān)鍵問題并沒有足夠的重視 。 它對細(xì)菌的裂解 ， 細(xì)菌染色體 DNA及蛋白質(zhì)變性充分 ， 所以提取的質(zhì)粒 DNA產(chǎn)量高純度好 。 ? 整個(gè)操作中物理剪切力小， 適用于大分子量的質(zhì)粒 DNA的提取。 細(xì)菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓 ， 減輕細(xì)菌裂解時(shí) DNA泄漏過快產(chǎn)生的機(jī)械剪切力 。 ? 另外 ， HB101及其它含有 endA+基因型的菌株表達(dá)中的核酸內(nèi)切酶 A， 在煮沸時(shí)不能完全失活 ， 在以后操作中 ，只要有 Mg2+存在 (如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 )，核酸內(nèi)切酶 A就可將質(zhì)粒 DNA降解 ， 而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 。 （二） 質(zhì)粒 DNA的制備 ? 質(zhì)粒 DNA的小量制備 25ml ? 質(zhì)粒 DNA的大量制備 500ml ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? SDS裂解法 ? Triton溶菌酶法 （三）質(zhì)粒 DNA提取方法的選擇 ? 常用的煮沸法 ， 堿法 ,SDS法均可獲得較滿意效果 ． 至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒 ， 用煮沸法或 SDS法進(jìn)行質(zhì)粒 DNA的大量分離 ， 只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問題 . ? 但是對于不同的菌株和不同大小的質(zhì)粒 DNA分子及以后進(jìn)行的不同實(shí)驗(yàn)等具體情況 ， 選擇哪種方法制備質(zhì)粒 DNA，應(yīng)考慮以下因素： 1．菌株類型 ? 大量提取 HB101， TGl菌株中的質(zhì)粒 ． 不提倡選擇煮沸法 ， 這類細(xì)菌富含糖類 ， 在煮沸或去污劑裂解細(xì)菌時(shí) ， 大量釋放出來 。 ? 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及 DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對閉合環(huán)狀雙鏈 DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)
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