【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長(zhǎng)度 取代型載體（置換型載體） 體外包裝 體外包裝 插入片段 最小裝載長(zhǎng)度 10 kb （ 51 – 26） 載體長(zhǎng)度 26 kb 插入片段 最大裝載長(zhǎng)度 25 kb （ 36 – 26） ? 允許外源 DNA 片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為置換型載體（ replacement vectors）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是 923kb ，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫(kù)。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 野生型的 lDNA鏈上有 5個(gè) EcoRI位點(diǎn)和 7個(gè) HindIII位點(diǎn)，不 利于重組操作，必須刪除至 1 2個(gè) 同時(shí)，為了便于各種來源的 DNA片段的克隆，還需要增加一 些單一的酶切位點(diǎn) 除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶 位點(diǎn) 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 與質(zhì)粒不同，野生型 lDNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此 加裝 選擇標(biāo)記是 lDNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容 lDNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類： 免疫功能類標(biāo)記 顏色反應(yīng)類標(biāo)記 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 imm434 imm434基因編碼一種阻止 l噬菌體 進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記 基因的 l載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶 原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑； 當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅 活， l重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成 透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 lacZ lacZ基因編碼 b半乳糖苷酶，能催化 無色的 Xgal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基 因插入到 lacZ基因中，基因滅活，不能 合成藍(lán)色化合物；而空載體 lDNA則產(chǎn) 生藍(lán)色透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突變 。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因 ， 其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變 。 將野生型 lDNA上 D和 E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。 當(dāng)這種 lDNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后 ， 不能合成有活性的頭部蛋白 ， 也就不能被包裝和裂解細(xì)菌 ， 這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散 ， 而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的主要類型： 插入滅活型載體 Charon Charon lgt11 取代型載體 lEMBL lgtlc、 lNM76 Charon40 正選擇型載體 lEMBL lL4 l1059 野生型的 l噬菌體不能在 P2噬菌體溶源性 的細(xì)菌中繁殖（ Spi+）， 這種生長(zhǎng)抑制表型受 lDNA上的 red和 gam兩個(gè)基因控制。若將外 源 DNA取代 red和 gam， 重組 噬菌體便擁有 Spi表型，能在 P2噬菌 體 溶源性 的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA重組分子的體外包裝： lDNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 l噬菌體的大腸桿菌中提取 ， 現(xiàn)已商品化 。 這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少 E組份 ， 另一部分則缺少 D組份 。 包裝時(shí) ， 當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后 ， 包裝才能有效進(jìn)行 ， 任何一種蛋白包裝液被重組 lDNA污染后 ， 均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 ， 這也是基于安全而設(shè)計(jì)的 λDNA 的體外包裝 是提高 λ 噬菌體 轉(zhuǎn)染效率 的有效方法 在 A蛋白 （有終止復(fù)制功能）， E蛋白 （是包裝蛋白）， D蛋白 （是插入蛋白）共同作用下使重組體 DNA轉(zhuǎn)入頭部。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA及其重組分子的分離純化： 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 加入 l噬菌體或重組 l噬菌體的懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 4 12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá) 1013 1014 / L， 大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放 lDNA 乙醇或異丙醇沉淀 lDNA 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)： lDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 lDNA載體的裝載能力為 25 kb， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組 lDNA分子 的篩選較為方便 重組 lDNA分子的提取較為簡(jiǎn)便 lDNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源 DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因 ? 表達(dá)載體 pET5a 是典型的 pET 載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了 T7 噬菌體啟動(dòng)子序列及其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA M13噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) M13噬菌體的外型呈絲狀 M13 噬菌體 由外殼包裝蛋白和 正 鏈 DNA組成 M13 DNA全長(zhǎng) 6407個(gè)核苷酸 M13 DNA上 至少有 10個(gè)基因 2700個(gè)外殼蛋白分子 M13 噬菌體 不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng) ? M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 （GenBank 注冊(cè)號(hào)為 V00604） ?；蚪M 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大的間隔位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因 Ⅱ ， Ⅴ 和 Ⅹ ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因 Ⅰ ， Ⅳ 和 Ⅺ ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因 Ⅲ 、 Ⅵ 、 Ⅶ 、 Ⅷ 和 Ⅸ ）?；蚪M DNA 為正鏈，按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。 ? M13 噬菌體顆粒為絲狀長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng) 880nm ，直徑 67nm 。噬菌體顆粒的核心由 2700 個(gè)基因 Ⅷ 編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因 Ⅷ 的產(chǎn)物為由 50 個(gè)氨基酸殘基組成的 α 螺旋蛋白。頂端由 5 個(gè)基因 Ⅶ 和 5 個(gè)基因 Ⅸ 產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號(hào)。 5 個(gè)基因 Ⅲ 蛋白和 5 個(gè)基因 Ⅵ 蛋白位于絲桿的末端，參與對(duì)性纖毛的吸咐。右圖是 M13 噬菌體結(jié)構(gòu)模型。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA M13噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期 + DNA （ +） DNA RFDNA RFDNA RFDNA DNA II V 在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型 DNA （ replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通過 θ 復(fù)制方式， RF DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始。基因組中的任意一個(gè)啟動(dòng)子都可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動(dòng)子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。 ? 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。 RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA M13 DNA載體的構(gòu)建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列載體 lacZ‘ polylinker 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA M13 DNA載體的特點(diǎn)： 使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外 這在 DNA定向突變中非常有用 M13重組分子篩選簡(jiǎn)便 被 M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混 濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 噬菌體或病毒 DNA 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病 毒基因組 DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病 毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： 單鏈 DNA病毒 雙鏈 DNA病毒 單鏈 RNA病毒 雙鏈 RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的 DNA中間反應(yīng)物， 這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的 DNA重組。 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 lDNA載體和 M13DNA載體的裝載量最大分別為 25 kb和 kb， 但在很多情況下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段， 考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的