廣西地方標準豬藍耳病病毒美洲型經(jīng)典株、變異株以及歐洲型毒株的檢測多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿編制說明(編輯修改稿)
2024-09-16 18:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 EUORF5RCTGCAATGAGGTGGGCTACAACTAACCCCTTCGAGGACG ACAT 歐洲型毒株614注：COORF7F和COORF7R引物對擴增美洲型毒株時長度為433 bp，擴增歐洲型毒株時長度為398 bp。 AMNsp2F和AMNsp2R引物對擴增美洲型經(jīng)典株時長度為338 bp, 擴增美洲型變異株時長度為248 bp。EUORF5F和EUORF5R引物對擴增歐洲型毒株的長度為614 bp。（4）樣品來源廣西動物疫病預(yù)防控制中心 2013 年至 2015 年從廣西各地采集的203份疑似 PRRS 病豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織。方法（1）待檢樣品的處理無菌采取病豬肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等共約1 g， mL離心管中，加入滅菌的1 mol/L PBS（pH ）1mL，用組織勻漿機充分研磨后，反復(fù)凍融3次；細胞培養(yǎng)物則直接反復(fù)凍融3次。以10 000 g離心5 min，收集上清，用于總RNA抽提，或置 20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ鍢悠房芍苯佑糜诳俁NA抽提，或置 20 ℃保存?zhèn)溆?。?）待檢樣品總RNA提取取待檢樣品上清200 181。L置于無 mL離心管中，加入 200 181。L Buffer VGB，20 181。L的 Proteinase K， 181。L的Carrier RNA，充分混勻，置56℃水浴鍋溫浴10 min；向上述裂解液中加入200 181。L無水乙醇，充分吸打混勻。將Spin column安置于Colletion Tube上，溶液移至Spin column中（ mL收集管上），12 000 rpm離心2 min，棄濾液；將 500 181。L的Buffer RWA加入到Spin column中；12 000 rpm離心1 min，棄濾液；將 800 181。L的Buffer RWB加入到Spin column中；12 000 rpm離心1 min，棄濾液；12 000 rpm離心Spin column 2 min；將Spin mL的離心管上，在Spin column膜的中央處加入 50 181。L的RNase free dH2O，室溫靜置5 min；12 000 rpm離心2 min，洗脫病毒RNA。（3）反轉(zhuǎn)錄在冰浴條件下，在 PCR反應(yīng)管中按下表用量分別加入各成分：試劑名稱用量終濃度10 RT Buffer1 181。L1 倍dNTP Mixture（10 mM each）1 181。L1 mmol/181。LRnase Inhibitor（40 U/181。L） 181。L1 U/181。LAMV Reverse Transtriptase (5 U/181。L) 181。L U/181。LMgcl2（25 mM ）2 181。L5 mmol/181。LRandom 9 mers (50 pmol/181。L) pmol/181。L待檢總RNA模板2 181。L加滅菌雙蒸水至總體積為10 181。L加完試劑后瞬時離心混勻，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，按以下循環(huán)條件進行RT反應(yīng)：① 30℃，10 min；②42 ℃，30 min；③ 95℃，5 min。（4）多重PCR的建立在冰浴條件下，在PCR 反應(yīng)管中按下表用量分別加入各成分：試劑名稱用量終濃度5 PCR Buffer（含dNTP Mixture、Mg2
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