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2025-01-23 15:21本頁面
【正文】 threshold ） ： ? 前 15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（ baseline），即 樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 ? 熒光域值的缺省設(shè)置是 3～ 15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準偏差的 10倍 ? 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于 ? 真正的信號 :熒光信號超過域值 實時熒光定量 PCR 原理 Ct值 Ct值的定義 ： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增 循環(huán)次數(shù) C(t) value 實時熒光定量 PCR 原理 Ct值的重現(xiàn)性 橫軸： PCR反映循環(huán)數(shù) 縱軸：熒光信號量 Ct值的特點 ： ?相同模板進行 96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； ? Ct值則極具重現(xiàn)性 實時熒光定量 PCR 原理 定量原理 ?理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0*2n ?非理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0 (1+Ex)n ? n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) ? X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 ? X0：初始模板量 ? Ex：擴增效率 實時熒光定量 PCR 原理 定量原理 在擴增產(chǎn)物達到閾值線時 : XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量 . 在閾值線設(shè)定以后 ,它是一個常數(shù) ,我們設(shè)為 M 方程式 (1)兩邊同時取對數(shù)得 : log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式 (2)得 : log X0= log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到 域值的循環(huán)數(shù)即 Ct值 就可計算出樣品中所含的模板量 實時熒光定量 PCR 原理 標(biāo)準曲線 ? 模板 DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct值越小 ? Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線，根據(jù)樣品 Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量 ?確定未知樣品的 C(t)值 ?通過標(biāo)準曲線由未知樣品的 C(t)值推算出其初始量 Sample 實時熒光定量 PCR原理 絕對定量 25 講 座 提 綱 ? 實時熒光定量 PCR原理 ? 實時熒光定量 PCR的幾種方法介紹 ? 實時熒光定量 PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用 實時熒光定量 原理實時熒光定量 的幾種方法介紹實時熒光定量 實驗設(shè)計及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： TaqMan Molecular Beacon Amplisensor 實時熒光定量 PCR 原理 DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記 Q Q R 實時熒光定量 PCR 方法 1 SYBR Green 法 SYBR Green SYBR Green 法 工作機理 ? SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈 DNA的小溝部位 ? SYBR Green 只有和雙鏈 DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 ? 變性時， DNA雙鏈分開，無熒光 ? 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈 DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。為了與逆轉(zhuǎn)錄 PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量 PCR”(quantitative PCR)或者 QRTPCR(quantitative realtime PCR)。兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象，這可能是因為體系更加單一比較利于 PCR的進行。 1 ?g ? 單管一步法 反轉(zhuǎn)錄和 PCR反應(yīng)在一個管子中完成 ，得到的全部 cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng) PCR擴增 ，靈敏度更高，但是容易相互干擾 。 反轉(zhuǎn)錄實驗步驟 1
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