rna的提取ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-13 15:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 een I 熔解曲線分析 ? 將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。 (dI/dT) dI dT Tm SYBR Green 法 融解曲線分析 融解曲線分析，單一峰 無非特異性熒光 定量準確 融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰 其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確 非特異性產(chǎn)物 Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 ? 模板 DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少 ? Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品 Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量 SYBR Green 法 PCR反應(yīng)的建立 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 : 1. SYBR Green 使用濃度 :太高抑制 Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測 2. Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準 3. MgCl2的濃度 :可以降低到 ,以減少非特異性產(chǎn)物 4. 反應(yīng) Buffer 體系的優(yōu)化 5. 反應(yīng)溫度和時間參數(shù) :由酶和引物決定 6. 其他與常規(guī) PCR相同 SYBR Green 法 應(yīng)用范圍 ? 起始模板的測定 ? 基因型的分析 ? 融解曲線分析：可以優(yōu)化 PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對 primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。 SYBR Green 法 優(yōu)缺點 ? 對 DNA模板沒有選擇性 適用于任何 DNA ? 使用方便 不必設(shè)計復(fù)雜探針 ? 非常靈敏 ? 便宜 優(yōu) 點 ? 容易與非特異性雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過 融解曲線的分析 ，優(yōu)化反應(yīng)條件 ? 對引物特異性要求較高 缺 點 與目標序列互補 實時熒光定量 PCR 方法 2 TaqMan法 TaqMan水解型雜交探針 ? 5′ 端標記有報告基團 (Reporter, R) ，如 FAM、 VIC等 ? 3′ 端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) ? 探針完整， R所發(fā)射的熒光能量被 Q基團吸收 ，無熒光， R與 Q分開，發(fā)熒光 ? Taq酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探針 TaqMan法 工作原理 每擴增一條 DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光 TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立 引物、探針的設(shè)計： 探針 Tm為 6870℃ ， 30 bp, 5’不能有 G， G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴增片段 400 bp，引物 Tm為 5960℃ 反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為： 94 ℃ ， 1020S 60℃ ， 3060S（ Taq酶 5′→3′ 外切核酸酶活性在 60℃ 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ℃ ， 45 S， 優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小 Ct值，最大信號 /背景比值 引物濃度： 50900nM 探針濃度： 50250nM 其他與常規(guī) PCR相同 乙肝病人血液中 HBV的絕對定量 ?目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù) ?方法：從血液中提取病毒 DNA，擴增病毒基因，以 TaqMan探針進行檢測 ?設(shè)置對照：濃度為 10 105 、 104 、 103 的標準樣品各一個，設(shè)陰性和空白對照 ?實驗步驟：提取 HBV DNA 設(shè)計特異引物 設(shè)計 TaqMan探針并標記探針
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