蛋白質(zhì)的提取ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 06:15 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 思考：如何配制不同 PH值不同的緩沖液？ 實(shí)驗(yàn)四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 【 目的要求 】 掌握電泳技術(shù)的一般原理和基本操作過(guò)程。 熟悉血清中蛋白分類(lèi)以及電泳分離操作。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 ：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 在一定 pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，它們的電泳遷移率不同。 V=EQ/(6πrη) M=V/E=Q/(6πrη) V：電泳速度 M：遷移率 E：電場(chǎng)強(qiáng)度 Q：顆粒帶電荷量 r：球形分子半徑 η ：介質(zhì)粘度 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 2. 影響電泳的因素： 內(nèi)在因素： 蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀 外界因素： 電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的 pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素 決定 運(yùn)動(dòng)方向 電場(chǎng) 作用力 形成 阻力 決定 運(yùn)動(dòng)速率 電荷性質(zhì) 電荷量 分子形狀 分子大小 √ √ √ √ √ √ √ （如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后， 涂抹成均勻的薄膜 則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為 120μ m，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn) 血清蛋白參考值 等電點(diǎn) 分子量（ kDa） 占總蛋白的百分?jǐn)?shù) (%) 清蛋白 69 61~71 α 1球蛋白 200 3~4 α 2球蛋白 300 6~10 β 球蛋白 90~150 7~11 γ 球蛋白 156~950 9~18 4. 經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為 5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、 α1 球蛋白、 α2 球蛋白、 β 球蛋白及 γ 球蛋白，經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)的百分含量。 【 實(shí)驗(yàn)器材 】 1. DYY6C型 雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀和 DYYⅢ 型電泳槽 （ 2 cm 8cm）： 1片 /人。 ：一排桌子公用 5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用 3套。 ：載玻片 。 ：公用。 ：一個(gè) /組。 【 實(shí)驗(yàn)試劑 】 巴比妥 巴比妥鈉緩沖液 (， mol/L，離子強(qiáng)度 ) % 氨基黑 10B染色液 漂洗液 將 2 8 cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡 15 min左右，至完全浸透，方可用于點(diǎn)樣。 【 實(shí)驗(yàn)操作 】 用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi) 吸干 多余的緩沖液，迎光判斷光面與 無(wú)光澤面 。用邊緣整齊的玻片沾取 少量 無(wú)溶血血清，垂直按壓于醋纖膜 標(biāo)號(hào) 一端約 ㎝ 處 (約 2～ 3μl) 泳 將 點(diǎn)樣端 的薄膜平貼在 陰極 濾紙橋上（ 點(diǎn)樣面朝下 ），另一端平貼在陽(yáng)極濾紙橋上 (見(jiàn)下圖 )。要求薄膜 緊貼 濾紙橋并 繃直 ，中間不能下垂。 平衡片刻 (23min)；使其自然充滿(mǎn)緩沖液；而后電壓 120V，電流 ～ ㎝ ，通電 45分鐘。 ： 電泳完畢后將薄膜取下 , 放在含氨基黑 10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡 35 min ： 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次(34次 )， 直至條帶清晰 為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 。 6. 記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 漂洗完畢后將薄膜取出 , 放在濾紙上。將薄膜上的 5條色帶
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