蛋白質(zhì)復性ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 06:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 IL11； 一般說來，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復性效率在 20%左右 2）蛋白質(zhì)的復性濃度 I向 N的轉(zhuǎn)化是 一級 反應(yīng)，而聚沉是 二級或多級 反應(yīng) 聚沉的反應(yīng)速度與蛋白質(zhì)濃度的平方或高次方成正比 而復性反應(yīng)過程與蛋白質(zhì)濃度的一次方成正比，故濃度越大，聚沉反應(yīng)越明顯。 →復性時蛋白質(zhì)濃度宜低 （低濃度時，獲得的蛋白質(zhì)復性效率比高濃度要好的多） 濃度過低又給后處理帶來不便 ，一般選擇 10－ 100μg／ ml，以避免分子間相互作用力引起聚集。 ? 3）變性劑濃度和復性時間 ? 在 高濃度變性劑 存在時，蛋白質(zhì)主要以 U存在（ 6mol/L 鹽酸胍、8mol/L Urea等）；在 中間濃度 時（ 較低濃度 的鹽酸胍和Urea），主要以 I存在，即能抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，又不會妨礙蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用的形成。 ? 由于 I向 N轉(zhuǎn)化是一個慢的過程，當?shù)鞍踪|(zhì)在此時放置較長的一段時間， I就可以慢慢地向 N轉(zhuǎn)化 ? 4）氧化還原環(huán)境 ? 復性不僅要降低或去除變性劑，同時必須提供 SH氧化形成 SS的環(huán)境 → 合適的氧化還原環(huán)境 ? 采用 配對的氧化型和還原型巰基物質(zhì) ? 配對低分子量巰基試劑包括 GSSG/GSH、半胱氨酸或巰基乙醇 /胱氨酸等。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為 l~3mmol/L，還原型 /氧化型的摩爾比為 10： 1或 5： 1。 5） pH和溫度 最適宜的復性 pH值應(yīng)大于 （ 一般 ），以防止自由 SH的質(zhì)子化作用影響正確配對的 SS的形成。 應(yīng)避免在蛋白質(zhì) pI處進行復性（蛋白質(zhì)的靜電排斥力幾乎為零，相互間疏水作用區(qū)域就容易作用而形成 A）。 溫度過高，蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴重，低溫下聚集和折疊反應(yīng)都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快 →常在室溫下進行 6）折疊促進劑 能夠促進蛋白再折疊的化學物質(zhì)統(tǒng)稱為折疊促進劑，折疊促進劑的作用原理在于穩(wěn)定復性蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、抑制肽鏈間的疏水相互作用。 應(yīng)用于蛋白質(zhì)復性并具有顯著效果的折疊促進劑有 表面活性劑、聚乙二醇 PFG、 L－精氨酸、抗體、分子伴侶 等。 例：人 ?干擾素的后處理工藝 發(fā)酵液 離心 (發(fā)酵液冷卻至 10?C以下 ， 4000r/min離心 10min) 菌體 細胞破碎 (1倍體積細胞 +10倍體積 PBS buffer, 冰浴超聲破碎 5次 , 30s/次 , 4000r/min離心 30min)， 洗滌 (% Triton X100溶液 ， 1000r/min離心 20min， 重復三次 ) 包涵體提取變性 (包涵體 +8M 尿素 pH 50mM TrisHCl buffer mM EDTA, 10mM DTT室溫攪拌 2h, 離心 (15000r/min, 30min) 例：人 ?干擾素的后處理工藝 變性蛋白液 稀釋 (取 1份變性液 +99份上述 buffer(不含 DTT與尿素 )， 使尿素終濃度小于 ， 4?C下攪拌 24h） 復性液 濃縮 (用截留 10kDa的超濾器濃縮 100倍 )， 透析后離心(15000r/min離心 30min) 濃縮上清液 Sephacryl s200柱層析分離：層析柱 2?100cm， pH 50mM TrisHCl buffer 平衡洗脫 稀釋 \透析 \超濾 復性法 折疊促進劑協(xié)助復性法： 表面活性劑、 PEG、 分子伴侶 等 反相膠團復性法、雙水相體系復性法 層析折疊復性（固相復性）： 凝膠過濾層析（ GF）、親和層析（ AFC） 、離子交換層析（ IEC） 、疏水層析（ HIC）等 蛋白質(zhì)復性時聚集反應(yīng)的抑制 復性中最重要的是抑制復性過程的聚集反應(yīng)。 最常用的是使用聚集反應(yīng)的抑制劑，其原理為： ? 穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)， ? 降低錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性， ? 增加折疊復性中間體的溶解度， ? 增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解度， ? 減少復性中間體接觸發(fā)生聚集反應(yīng)。 聚集反應(yīng)抑制劑的種類： 1. 可促進蛋白質(zhì)折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍或尿素，以及一些離液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺類化合物等。在非變性濃度下，是很有效的促進劑。 2. 對于某些需要輔因子才表現(xiàn)活性的蛋白質(zhì)，
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