【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 二抗雜交 二抗算不算多余？一抗不能顯色嗎？ 一抗是特異性的 ， 常用單抗 。 二抗要求廣譜抗體 ， 最好能夠一對(duì)多 。 一抗如果是鼠抗人的抗體 ， 二抗應(yīng)該是另一種動(dòng)物抗鼠的抗體 ， 而且 一抗和二抗的動(dòng)物種屬原則上不應(yīng)該相同 。 一般來說 ， 一抗多用兔抗和鼠抗 ，而二抗多用羊抗 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （ 7） 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 ?辣根過氧化物酶法（ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） ?化學(xué)發(fā)光顯色法 (HRP) 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照 （ βactin，GAPDH ） ， 應(yīng)先上目的蛋白的一抗 、 二抗 ，顯色 、 壓片 、 洗片；漂洗以后 ， 再上內(nèi)對(duì)照的一抗 、 二抗 ， 顯色 、 壓片 、 洗片 。 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 DAB、 ECL法都能達(dá)到納克的要求 。 ECL是一種增強(qiáng)顯色法 ， 靈敏度要高 ， 但顯色麻煩 ， 發(fā)表文章常用 。 DAB（ 3,3二氨基聯(lián)苯胺 ） 和 HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物 。 這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有機(jī)溶劑 ， 對(duì)于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想 。 常用顯色法的原理 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 Ecl 顯色原理 ：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物 ， 是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑 。 魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物 ， 也可用作過氧化物酶的底物 。 在 Ecl底物中 ， 含有 H2O2和魯米諾 ， 在HRP（ 辣根過氧化物酶 ） 的作用下 ， 發(fā)出熒光來 。 注意：熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來越弱 。 常用顯色法的原理 免疫印跡法 成功例子 。 B. Western blot I mRNA 數(shù)據(jù)分析 D. Col I蛋白數(shù)據(jù)分析 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 雜交結(jié)果的分析 Western blotting 可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子 ， 進(jìn)行定量和半定量分析 ， 但是不能定位 。 定量 Western Blotting技術(shù)需要具備兩個(gè)必要條件 。 其一：信號(hào)必須穩(wěn)定 ， 保證不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)都可以得到相同的結(jié)果；其二：信號(hào)的強(qiáng)弱必須與目標(biāo)蛋白深度成比例關(guān)系 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 利用紅外激光器產(chǎn)生的激光激發(fā)紅外熒光染料 ， 產(chǎn)生的發(fā)射光由高靈敏度光電二極管檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度 。 熒光信號(hào)一經(jīng)激發(fā)出來就是穩(wěn)定的 ， 不隨時(shí)間變化；熒光強(qiáng)弱與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系 （ 濃度越高 ， 結(jié)合的染料越多 ， 熒光信號(hào)越強(qiáng) ） ， 根據(jù)熒光強(qiáng)弱就可以對(duì)蛋白進(jìn)行精確的定量分析 。 之 雜交結(jié)果的分析 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) Western blot 的半定量 將圖片掃描保存為電腦文件 ， 用分析軟件 （ 如： GIS1000） 將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化 。 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差 ， 所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量 。 之 雜交結(jié)果的分析 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 雜交結(jié)果的分析 免疫組化可以用來進(jìn)行定位 ， 但是不能精確定量 ， 有時(shí)會(huì)有假陽性 。 免疫組化定量分析 （ 半定量 ） ：用ＤＡＢ對(duì)免疫組化產(chǎn)物染色 ， 同時(shí)用蘇木對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染 。 鏡下觀察樣品 ， 細(xì)胞核被染上了藍(lán)色 ， 胞漿間有黃色 （ 強(qiáng)陽性的地方會(huì)呈現(xiàn)棕黃色 ） 。 根據(jù)細(xì)胞著色深度及陽性細(xì)胞數(shù) 分別記分為0～ 3 分 ,著色深度以多數(shù)細(xì)胞呈色程度為準(zhǔn) 。 常用 軟件進(jìn)行處理 ， 如 image pro plus （ IPP5） 。 免疫印跡法 Western Blotting 常見問題分析 Western Blotting 常見問題分析 不恰當(dāng)?shù)臉悠分苽鋾?huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗 新手采用含 TritonX100或 NP40的緩沖液裂解組織或細(xì)胞 ，結(jié)果無蛋白條帶 。 因?yàn)椴襟E太多 ， 新手無法保證每一步操作都正確 。 SDSPAGE上樣樣品中蛋白實(shí)際含量較低 。 Western Blotting 常見問題分析 SDSPAGE 不完美 ? 膠不平？ ? 凝膠漏液？ ? 膠板洗刷干凈 ? 加入 APS和 TEMED的量要合適 ? 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 ? 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 ? 兩塊玻璃板底部要對(duì)齊 Western Blotting 常見問題分析 ? 條帶比正常的窄？ ? “ 微笑 ” 或 “ 倒微笑 ” 條帶？ 4， 5，6， 7 ? 凝膠聚合不均勻 ， 灌膠時(shí)候盡量混合均勻 ， 動(dòng)作輕緩 ? 拔梳子要迅速 ， 清洗加樣孔要小心 ， 以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一 ， 純化樣品 ， 調(diào)整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果 ，應(yīng)趕走氣泡 。 同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適 SDSPAGE 不完美 Western Blotting 常見問題分析 SDSPAGE 不完美 條帶 9的形狀 ， 屬電泳條件比較合適的區(qū)帶 ，其余都是電泳條件不太理想所致 。 影響區(qū)帶形狀因素：凝膠的孔徑 ， 樣品的鹽濃度 ， 蛋白質(zhì)的量 （ 如 8， 量太多 ， 帶向下垂 ） ， 電泳過程中產(chǎn)生的熱 ， 點(diǎn)樣的位置 （ 如在膠的左 、 右端的樣品 ， 因電壓關(guān)系常出現(xiàn)歪斜 ） ， 濃縮膠點(diǎn)樣槽的底部不平也造成區(qū)帶的歪斜 。 Western Blotting 常見問題分析 SDSPAGE 不完美 條帶呈笑臉狀 原因：凝膠不均勻冷卻 ， 中間冷卻不好 。 拖尾：樣品溶解不好 。 紋理 （ 縱向條紋 ） ：樣品中含有不溶性顆粒 。 條帶呈皺眉狀 ， 可能是由于裝置不合適 ， 特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡 ， 或者兩邊聚合不完全 。 Western Blotting 常見問題分析 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè) ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“ 三明治 ” 結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙 ? 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 Western Blotting 常見問題分析 一抗?jié)舛扔绊懡Y(jié)果 一抗?jié)舛忍?， 導(dǎo)致沒有特異帶 。 可能與抗體 抗原結(jié)合的所謂空間位阻現(xiàn)象有關(guān) ， 也可能是高濃度抗體導(dǎo)致的高背景會(huì)洇滅特異信號(hào) 。 Western Blotting 常見問題分析 背景太高 protein protein 背景太高 背景較淺 對(duì)比度要好 。 Western Blotting 常見問題分析 背景太高 1. 膜沒有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 5. 抗體濃度過高 原因 對(duì) 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 4. 雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度 Western Blotting 常見問題分析 背景太高 從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟 ， 一定要注意膜的保濕 ，避免膜的干燥 ， 否則極易產(chǎn)生較高的背景 。 對(duì)于一些背景較高的抗體 ， 可以在 4℃ 封閉過夜 。 如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù) 。 Western B