【正文】 ① PBS沖洗完畢后 ， 加入抗體 ， 如一抗 ， 二抗或三抗 。 除去切片上多余的 PBS， 但不能讓切片干涸 。 切片上 PBS存留過多 ， 將會(huì)稀釋加入的抗體 ，影響加入抗體的濃度 ， 同時(shí)也將影響最后的結(jié)果 ，如假陰性等 。 切片干涸 ， 往往可產(chǎn)生非特異性染色 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) ② 加入的抗體以一滴為佳 。 當(dāng)擦干組織塊周邊多余的 PBS后 ， 切片保持著一定的濕潤度 ， 此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候 ， 滴入抗體以 一滴 50ul為好 ， 加入后 ， 輕微 、 搖勻覆蓋于切片 上 ， 使最后的結(jié)果穩(wěn)定均衡 ， 不至于有的地方有反應(yīng) ， 有的地方無反應(yīng) 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 7. 選擇合適的孵育時(shí)間 按說明書操作 。 不主張于 4℃ 冰箱中過夜 ， 原因是： ， 或者被吸附 ， 造成背景的染色 。 ， 純度較高 ， 特異性較強(qiáng) ， 不需要長時(shí)間的孵育 ， 也能夠結(jié)合得很好 。 ， 容易引起切片脫落 ， 造成染色的失敗 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 8. PBS的沖洗 免疫組化的染色過程 ， 除了前面的處理和加入抗體外 ， 都在 PBS的沖沖洗洗中度過 ， PBS沖洗的正確與否 ， 也是導(dǎo)致最后結(jié)果的關(guān)鍵 。 ① 單獨(dú)沖洗 ， 防止交叉反應(yīng)造成污染 。 ② 溫柔沖洗 ， 防止切片的脫落 。 ③ 沖洗的時(shí)間要足夠 ， 才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì) 。 免疫組化法 免疫 組化 法與免疫 印跡 法比較 項(xiàng)目 方法 一抗 定位 定量 假陽性 免疫組化 線性表位 構(gòu)象形表位 Yes 不能 精確定量 有 Western blotting 線性表位 No Yes No 免疫組化法 之 主要用途 免疫組化法 對目的蛋白進(jìn)行如下研究： 定位 定性 定量 棕黃色（陽性），細(xì)胞核 免疫熒光法 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證 一 1 免疫熒光法 根據(jù) 抗原抗體 反應(yīng) ， 把已知的 抗原或抗體標(biāo)記上 熒光素 ， 制成熒光抗原或抗體 ， 然后以它作為 探針 來檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)物質(zhì) 。 免疫熒光法 之 原理 免疫熒光法 熒光抗體染色 熒光素直接 標(biāo)記 特異性抗體 （ — 抗 ） 上 ， 標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合 （ 在切片上 ） ,熒光顯微鏡下觀察→ 檢測抗原 。 1. 直接法 優(yōu)點(diǎn) ：簡單 ， 時(shí)間短 ， 特異性強(qiáng) 。 缺點(diǎn)： 靈敏度低 ， 所需抗體量大 （ 不經(jīng)濟(jì) ） 。 應(yīng)用：基本不用了 ！！ 免疫熒光法 2． 間接法 熒光素 標(biāo)記 在 二抗 上 （ 二抗：抗產(chǎn)生一抗動(dòng)物的 IgG抗體 ） 。 顯色后鏡檢 。 特點(diǎn)： 較直接法靈敏； 標(biāo)記一種抗體鑒定多種抗原 。 免疫熒光法 1. 顯示目的基因的表達(dá)情況 免疫熒光法 之 主要用途 免疫熒光法 免疫熒光法 1. 顯示目的基因的表達(dá)情況 2. 基因定位 因?yàn)檩^高的敏感性可以顯示出基因表達(dá)的亞細(xì)胞情況 (核內(nèi) ， 核外 ， 膜上以及一些較大的細(xì)胞器上 )。 免疫熒光法 之 主要用途 免疫熒光法 免疫熒光法 √ 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證 一 1 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 簡介 流式細(xì)胞術(shù) （ Flow Cytometry, 簡稱 FCM） 是一種可以快速 、 準(zhǔn)確 、 客觀 ， 并且同時(shí)檢測單個(gè)微粒 （ 通常是細(xì)胞 ） 的多項(xiàng)特性的技術(shù) ， 同時(shí)可以 對特定群體加以分選 。 研究對象為生物顆粒 ， 如各種細(xì)胞 、 染色體 、微生物 、 及人工合成微球等 。 研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征 ，并加以定量 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 實(shí)驗(yàn)原理 單細(xì)胞 懸液 熒光信號 激光束 磷酸緩沖液 流式細(xì)胞術(shù) 熒光信號的 強(qiáng)度代表 了所測細(xì)胞膜表面 抗原的強(qiáng)度 或其 核內(nèi)物質(zhì)的濃度 。 流式細(xì)胞術(shù) 之 實(shí)驗(yàn)原理 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 實(shí)驗(yàn)步驟 樣本處理 細(xì)胞計(jì)數(shù) 、 抗體染色 、 孵育 、溶血 、 固定 上機(jī)檢測 標(biāo)本準(zhǔn)備 ① ② ③ 自己完成 別人完成 + 抗體+ 支票 √ 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 標(biāo)本來源： 外周血 、 骨髓 、 組織塊 、 培養(yǎng)細(xì)胞 、脫落細(xì)胞及其他 。 標(biāo)本處理時(shí)間： 新鮮樣本分析時(shí) ， 樣本采集后應(yīng)立即分析 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 從組織獲取淋巴細(xì)胞方法： 淋巴節(jié) 、 扁桃體 、 脾 、 胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松散 ， 容易分離成單個(gè)細(xì)胞 。 一般對樣本進(jìn)行切剪 、 研磨 、 過濾便可 。 其他標(biāo)本： 通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用酶進(jìn)行消化 。 對于不同標(biāo)本 ， 處理方法也各不相同 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 其他類型細(xì)胞： 在組織中提取細(xì)胞通常使用 酶消化法 。 同樣對于不同組織處理方法也各異 。 許多原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞系 ， 都為貼壁型生長 。通常先用 胰酶處理獲得單細(xì)胞懸液 ， 需注意消化過度會(huì)損害細(xì)胞 ， 特別是改變其表面抗原標(biāo)記 。 流式細(xì)胞術(shù) 之 結(jié)果形式 散點(diǎn)圖 直方圖 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 應(yīng)用領(lǐng)域 細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 遺傳學(xué)應(yīng)用 臨床應(yīng)用 科研應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù) 之 細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 細(xì)胞大小 細(xì)胞粒度 細(xì)胞表面面積 核漿比例 DNA含量與細(xì)胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量 染色體分析 細(xì)胞表面 /胞漿 /核的特異性抗原 細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 酶活性 激素結(jié)合位點(diǎn) 細(xì)胞受體 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞功能 在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選 流式細(xì)胞術(shù) 之 遺傳學(xué)應(yīng)用 細(xì)胞 DNA, RNA 含量的測定 染色體倍體分析 染色體分離 基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究 基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng) 基因表達(dá)調(diào)控研究 細(xì)胞內(nèi)基因定位 酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選 報(bào)告基因的定性定量檢測 植物遺傳學(xué)研究 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 臨床應(yīng)用 HIV免疫分型 ， CD4絕對計(jì)數(shù) 白血病和淋巴瘤的免疫分型 腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測 干細(xì)胞計(jì)數(shù) 殘量白血病細(xì)胞檢查 HLAB27檢查 血小板功能及相關(guān)疾病 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 科研應(yīng)用 免疫功能研究 癌癥病人的多藥耐藥性 細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究 動(dòng)物性別篩選 海洋與環(huán)境微生物分析 染色體分選 流式細(xì)胞術(shù) What can Flow Cytometer tell us about a cell? 細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）、細(xì)胞分裂 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞散射光 、 熒光吸收 、 凋亡蛋白 、 線粒體功能 、鈣離子流和 pH值變化 、 DNA 鏈的斷裂 、 DNA含量 免疫功能 免疫細(xì)胞亞群 、 細(xì)胞因子 、 磷酸化 端粒長度 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分選 總結(jié) 免疫熒光法 √ 4 流式細(xì)胞術(shù) √ 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)原理 、 操作步驟 、 注意事項(xiàng) 、 主要用途 www.themegallery.com 謝謝大家的關(guān)注 ！