蛋白質(zhì)復(fù)性ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 06:01本頁面
【正文】 卵清溶菌酶 短鏈醇 正戊醇，正己醇， 碳酸酐酶 環(huán)己醇 蛋白質(zhì)復(fù)性的促進劑 分子內(nèi)沒有 SS鍵的蛋白質(zhì)復(fù)性相對比較簡單，只需抑制聚集反應(yīng)，不涉及 SS鍵的形成。 SS鍵的形成需要適當?shù)难趸€原條件，對于稀釋復(fù)性法，最簡單的方法是通入空氣，進行氧化形成 SS鍵，但氧化速度太慢；最常采用的是適當比例的氧化還原對，如 GSH/GSSG,形成 SS鍵，或使錯誤 SS鍵重排，促進正確 SS鍵的形成。在后續(xù)步驟加入強的氧化步驟，即加入過量的氧化型巰基試劑，或采用 Cu2+誘導(dǎo)的空氣氧化，以保證形成正確穩(wěn)定的 SS鍵。 多聚 Lys蛋白對肝素 瓊脂糖凝膠具有較強親和活性 吸 附 洗脫 固相復(fù)性的流程 柱上復(fù)性 變性劑去除 固相基質(zhì)：肝素 瓊脂糖凝膠 ? 由于凝膠基質(zhì)微孔的體積排阻效應(yīng)和減少的擴散效應(yīng)，部分折疊的蛋白質(zhì)之間的相互作用受到有效的阻擋 ? → 降低了發(fā)生聚集的可能性 ? 可溶性的聚集物、復(fù)性的蛋白、變性劑和氧化還原劑依次流出 Using GF 凝膠過濾 固相復(fù)性（柱上復(fù)性）優(yōu)缺點 ? 優(yōu)點： 在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時，可使目標蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達到純化的目的，使復(fù)性和純化同時進行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。 ? 缺點： 一旦復(fù)性時發(fā)生聚沉副反應(yīng)，使得柱堵塞且不可再生 → 經(jīng)濟損失較大 。 展 望 ? 研究蛋白質(zhì)變性復(fù)性機理，開發(fā)新的變性復(fù)性原理和技術(shù)，解決目前的技術(shù)關(guān)鍵。 ? 完善現(xiàn)有技術(shù)，實現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的實用化和規(guī)模化。 ? 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)原理，擴大應(yīng)用范圍。 ? 開發(fā)實用的設(shè)備。 許多變性蛋白質(zhì)在去除變性因素后，可自發(fā)地恢復(fù)它原來的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這稱為變性蛋白質(zhì)的再折疊或復(fù)性。 包涵體：外源目的基因在宿主系統(tǒng)中高水平表達時，因各種原因?qū)е禄虮磉_產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）雖然正確，而其高級結(jié)構(gòu)是錯誤的，即：沒有生物活性的包涵體。包涵體直徑約 ，具有很高的密度（約 mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。 減少包涵體形成的策略 : 1）降低重組菌的生長溫度：較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。 2）添加可促進重組蛋白質(zhì)可溶性表達的添加劑，如：培養(yǎng) （誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。 3）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、 pH等。 4）將目標蛋白與親水蛋白、分子伴侶、折疊酶等共表達； 包涵體形成的幾種可能性 : 1）少量蛋白產(chǎn)生時是可溶的，表達量過高，積聚量超過其在細胞內(nèi)溶解度時沉淀； 2）合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對； 3）蛋白產(chǎn)生量過多，所需其他成分 (如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等 )不足； 4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多、 Pro含量越高越容易形成包涵體。 5）重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高時容易形成包涵體。 6）豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。 包涵體的溶解 : pH8的條件下，用強變性劑如 8mol/L尿素、 6mol/L鹽酸胍，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸。 2. 對于含有 SS的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。為將包涵體充分溶解，需加入還原劑（如二硫蘇糖醇 DTT、 GSH、 β－巰基乙醇 βME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是 50100mM βME或 DTT（對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應(yīng)使用還原劑，因為含SS的雜蛋白會影響包涵體的溶解）。 ，如 EDTA，用來螯合 Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的 SH與之發(fā)生氧化反應(yīng)。 ，蛋白質(zhì)成為失去了生物學(xué)活性伸展肽鏈 蛋白質(zhì)體外復(fù)性的常用方法 : \透析 \超濾復(fù)性法； ：表面活性劑、 PEG、分子伴侶等； 3.反相膠團復(fù)性法、雙水相體系復(fù)性法； 4. 層析折疊復(fù)性（固相復(fù)性）：凝膠過濾層析（ GF）、親和層析（ AFC） 、離子交換層析（ IEC） 、疏水層析（ HIC）等
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