蛋白質(zhì)復(fù)性ppt課件-免費(fèi)閱讀
【正文】 2. 對于含有 SS的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。包涵體直徑約 ，具有很高的密度（約 mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。 多聚 Lys蛋白對肝素 瓊脂糖凝膠具有較強(qiáng)親和活性 吸 附 洗脫 固相復(fù)性的流程 柱上復(fù)性 變性劑去除 固相基質(zhì)：肝素 瓊脂糖凝膠 ? 由于凝膠基質(zhì)微孔的體積排阻效應(yīng)和減少的擴(kuò)散效應(yīng)，部分折疊的蛋白質(zhì)之間的相互作用受到有效的阻擋 ? → 降低了發(fā)生聚集的可能性 ? 可溶性的聚集物、復(fù)性的蛋白、變性劑和氧化還原劑依次流出 Using GF 凝膠過濾 固相復(fù)性（柱上復(fù)性）優(yōu)缺點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn)： 在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的，使復(fù)性和純化同時進(jìn)行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。 8. 分子伴侶和折疊酶，這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI)、肽酰 脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)、分子伴侶、 FK506結(jié)合蛋白、 Cyclophilin等。 4. 非離子型表面活性劑，尤其是離子型或兩性離子表面活性劑。在非變性濃度下，是很有效的促進(jìn)劑。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為 l~3mmol/L，還原型 /氧化型的摩爾比為 10： 1或 5： 1。 ? 如： 50mM TrisHCl， ， 2M尿素， 1mM EDTA 包涵體的溶解 ? 大多數(shù)在 pH8的條件下，用 強(qiáng)變性劑 如 8mol/L尿素、 6mol/L鹽酸胍， 打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展 ? 對于含有 SS的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些 鏈間 形成的二硫鍵和 鏈內(nèi) 的 非活性二硫鍵。 1） 少量蛋白產(chǎn)生時是可溶的， 表達(dá)量過高 ，積聚量超過其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時沉淀； 2） 合成速度太快，以至于 沒有足夠的時間 進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對； 3） 蛋白產(chǎn)生量過多，所需其他成分 (如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等 )不足； 4）重組蛋白的氨基酸組成， 一般說來含硫氨基酸越多、 Pro含量越高越容易形成包涵體。一些小分子單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的折疊過程相對簡單些；熱力學(xué)控制下能容易地進(jìn)行可逆的變性、復(fù)性；結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的蛋白質(zhì)，特別是涉及 SS鍵重排，脯氨酰順反異構(gòu)限速步驟的折疊反應(yīng)，總體上受熱力學(xué)控制，但折疊途徑即動力學(xué)控制比較重要。這就是“熱力學(xué)假說”。第十章 蛋白質(zhì)復(fù)性 refolding 提綱 1. 變性 unfolding與復(fù)性 refolding 變性 過程總伴隨著蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)的變化，如溶解度改變、體積變大、黏度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低、生物活性降低或消失等。 該理論認(rèn)為：蛋白質(zhì)天然構(gòu)象形成具有協(xié)同性，其能量差別足以區(qū)別天然構(gòu)象和其它構(gòu)象。 復(fù)性有關(guān)理論 兩個理論都認(rèn)同：蛋白質(zhì)的折疊是蛋白質(zhì)自身分子內(nèi)作用的結(jié)果，是由于暴露在溶液中的疏水側(cè)鏈的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三維空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。 5）重組蛋白所處的環(huán)境： 發(fā)酵溫度高時容易形成包涵體。 為將包涵體充分溶解，需加入還原劑 （如二硫蘇糖醇 DTT、 GSH、 β－巰基乙醇 βME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是 50100mM βME或 DTT（對于 目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵的有時也應(yīng)使用還原劑 ，因?yàn)?含 SS的雜蛋白 會影響包涵體的溶解） ? 加入 金屬螯合劑，如 EDTA，用來螯合 Cu2+、 Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的 SH與之發(fā)生氧化反應(yīng) 。 5） pH和溫度 最適宜的復(fù)性 pH值應(yīng)大于 （ 一般 ），以防止自由 SH的質(zhì)子化作用影響正確配對的 SS的形成。 2. 對于某些需要輔因子才表現(xiàn)活性的蛋白質(zhì)，輔因子、配基、或底物具有很好促進(jìn)折疊的作用。如 Chaps、 Triton X100、磷脂、十二烷基麥芽糖苷、磺酸甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用。分子伴侶和折疊酶不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。 ? 缺點(diǎn)： 一旦復(fù)性時發(fā)生聚沉副反應(yīng)，使得柱堵塞且不可
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