《蛋白質(zhì)復(fù)性》ppt課件-文庫(kù)吧
2025-04-18 06:01 本頁(yè)面
【正文】 分 (如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等 )不足； 4）重組蛋白的氨基酸組成， 一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多、 Pro含量越高越容易形成包涵體。 5）重組蛋白所處的環(huán)境： 發(fā)酵溫度高時(shí)容易形成包涵體。 6） 豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng) 培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。 減少包涵體形成的策略 1）降低重組菌的生長(zhǎng)溫度： 較低的生長(zhǎng)溫度降低了無(wú)活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。 2） 添加可 促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑， 如：培養(yǎng) 乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)） 、 低分子量的巰基或二硫化合物 （影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。 3）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件， 如 供氧、 pH等。 4） 將目標(biāo)蛋白與 親水蛋白、分子伴侶、折疊酶 等共表達(dá) ； 包涵體形成： Advantages 細(xì)菌的生長(zhǎng)快速利于大規(guī)模生產(chǎn)。包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度比較高， 有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的40% 重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在 →包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地 抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊 分離 比可溶蛋白質(zhì)的分離方法 簡(jiǎn)便 ，造價(jià)低 ，使用簡(jiǎn)單的離心或者過(guò)濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離 有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì) 對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死， 大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?；?包涵體形式的蛋白質(zhì)因喪失了生物活性 →高效地表達(dá) 路線(xiàn)二 A 成品加工 精制 (結(jié)晶、干燥 ) 高度純化 (層析、電泳 )脫鹽濃縮 初步純化 (鹽析、萃取、超濾等 ) 路線(xiàn)二 B 包涵體 溶解 (鹽酸胍、脲 ) 復(fù) 性 發(fā)酵液預(yù)處理 細(xì)胞分離 路線(xiàn)一 清液－胞外產(chǎn)物 路線(xiàn)二 細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物 細(xì)胞破碎 碎片分離 發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離 不溶物的去除 包涵體加工流程 離 心 去除細(xì)胞碎片 （ 膜蛋白和脂類(lèi)等） 機(jī)械破碎法 包涵體提取 如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行 高效體外復(fù)性 以獲得活性產(chǎn)品 是生物工程產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)難題 包涵體的洗滌 ? 為除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，應(yīng)用 洗滌液 洗滌 包涵體沉淀 ? 常用 去污劑 Triton Xl00或 脫氧膽酸鈉 和 低濃度變性劑 （如2mol/L尿素或鹽酸胍等，注意：過(guò)高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解）洗滌 以除去脂類(lèi)和膜蛋白 。 ? 如： 50mM TrisHCl， ， 2M尿素， 1mM EDTA 包涵體的溶解 ? 大多數(shù)在 pH8的條件下，用 強(qiáng)變性劑 如 8mol/L尿素、 6mol/L鹽酸胍， 打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展 ? 對(duì)于含有 SS的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些 鏈間 形成的二硫鍵和 鏈內(nèi) 的 非活性二硫鍵。 為將包涵體充分溶解，需加入還原劑 （如二硫蘇糖醇 DTT、 GSH、 β－巰基乙醇 βME）打開(kāi)蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是 50100mM βME或 DTT（對(duì)于 目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵的有時(shí)也應(yīng)使用還原劑 ，因?yàn)?含 SS的雜蛋白 會(huì)影響包涵體的溶解） ? 加入 金屬螯合劑，如 EDTA，用來(lái)螯合 Cu2+、 Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的 SH與之發(fā)生氧化反應(yīng) 。 ? 包涵體溶解后，蛋白質(zhì)成為失去了生物學(xué)活性伸展肽鏈 4. 蛋白質(zhì)復(fù)性 ? 蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，涉及兩種疏水相互作用： ? 一是 分子內(nèi)的疏水相互作用 ? → 促使蛋白質(zhì)正確折疊 ? 二是 肽鏈分子間的疏水相互作用 → 導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形成寡聚體和多聚體 → 再進(jìn)一步聚集形成沉淀 →兩者互相競(jìng)爭(zhēng)，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率。 →復(fù)性過(guò)程中， 抑制肽鏈間的疏水相互作用 以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。 伸展態(tài) U 中間體 I 局部肽段先由氫鍵形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如 α螺旋、 β折疊、 β轉(zhuǎn)角等 聚集體 A 天然態(tài) N 快 慢 影響復(fù)性效率的因素 1）蛋白質(zhì)本身的性質(zhì) 有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰 RNA酶有 12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到 95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如
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