【正文】 (包涵體 +8M 尿素 pH 50mM TrisHCl buffer mM EDTA, 10mM DTT室溫?cái)嚢?2h, 離心 (15000r/min, 30min) 例：人 ?干擾素的后處理工藝 變性蛋白液 稀釋 (取 1份變性液 +99份上述 buffer(不含 DTT與尿素 )， 使尿素終濃度小于 ， 4?C下攪拌 24h） 復(fù)性液 濃縮 (用截留 10kDa的超濾器濃縮 100倍 )， 透析后離心(15000r/min離心 30min) 濃縮上清液 Sephacryl s200柱層析分離：層析柱 2?100cm， pH 50mM TrisHCl buffer 平衡洗脫 稀釋 \透析 \超濾 復(fù)性法 折疊促進(jìn)劑協(xié)助復(fù)性法： 表面活性劑、 PEG、 分子伴侶 等 反相膠團(tuán)復(fù)性法、雙水相體系復(fù)性法 層析折疊復(fù)性（固相復(fù)性）： 凝膠過(guò)濾層析（ GF）、親和層析（ AFC） 、離子交換層析（ IEC） 、疏水層析（ HIC）等 蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制 復(fù)性中最重要的是抑制復(fù)性過(guò)程的聚集反應(yīng)。 →復(fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度宜低 （低濃度時(shí)，獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性效率比高濃度要好的多） 濃度過(guò)低又給后處理帶來(lái)不便 ，一般選擇 10－ 100μg／ ml，以避免分子間相互作用力引起聚集。 3）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件， 如 供氧、 pH等。 ? 在大腸桿菌中表達(dá)的基因工程蛋白常常以 包涵體 的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為 無(wú)活性的不溶性聚集物 包涵體： 外源目的基因在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，因 各種原因 導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物的 一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）雖然正確，而其高級(jí)結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的 ，即：沒(méi)有生物活性的包涵體。蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊是一些因素在折疊動(dòng)力學(xué)過(guò)程中起到控制作用。（ p384） 復(fù)性有關(guān)理論 蛋白質(zhì)從去折疊狀態(tài)向折疊狀態(tài)即天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，必須經(jīng)歷一個(gè)高自由能的 過(guò)渡態(tài) 。 許多變性蛋白質(zhì)在去除變性因素后，可自發(fā)地恢復(fù)它原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這稱(chēng)為變性蛋白質(zhì)的再折疊或 復(fù)性 。 蛋白質(zhì)在折疊過(guò)程中會(huì)有兩種途徑相互競(jìng)爭(zhēng)，一種是正確折疊形成天然構(gòu)象的途徑，另一種是錯(cuò)誤折疊成穩(wěn)定的非天然構(gòu)象的途徑。因此，該理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程的許多參數(shù)及其折疊機(jī)理可能與蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。 2） 添加可 促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑， 如：培養(yǎng) 乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)） 、 低分子量的巰基或二硫化合物 （影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。 伸展態(tài) U 中間體 I 局部肽段先由氫鍵形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如 α螺旋、 β折疊、 β轉(zhuǎn)角等 聚集體 A 天然態(tài) N 快 慢 影響復(fù)性效率的因素 1）蛋白質(zhì)本身的性質(zhì) 有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰 RNA酶有 12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到 95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如 IL11； 一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在 20%左右 2）蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度 I向 N的轉(zhuǎn)化是 一級(jí) 反應(yīng)，而聚沉是 二級(jí)或多級(jí) 反應(yīng) 聚沉的反應(yīng)速度與蛋白質(zhì)濃度的平方或高次方成正比 而復(fù)性反應(yīng)過(guò)程與蛋白質(zhì)濃度的一次方成正比，故濃度越大，聚沉反應(yīng)越明顯。 應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性并具有顯著效果的折疊促進(jìn)劑有 表面活性劑、聚乙二醇 PFG、 L－精氨酸、抗體、分子伴侶 等。 3. PEG促進(jìn)折疊復(fù)性， PEG與復(fù)性中間體特異形成非聚集的復(fù)合物，阻止復(fù)性時(shí)疏水中間體的聚集，復(fù)合物折疊形成第二個(gè)中間體，并不再與 PEG結(jié)合。 6. 短鏈醇類(lèi)、高滲物，如乙醇、甘油等對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，可有效降低低聚體的形成。這稱(chēng)為人工伴侶復(fù)性。 ? 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)原理，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。 4）將目標(biāo)蛋白與親水蛋白、分子伴侶、折疊酶等共表達(dá)； 包涵體形成的幾種可能性 : 1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過(guò)高，積聚量超過(guò)其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀； 2）合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)； 3）蛋白產(chǎn)生量過(guò)多，所需其他成分 (如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等 )不足； 4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多、 Pro含量越高越容易形成包