蛋白質(zhì)復(fù)性ppt課件-文庫吧資料
2025-05-09 06:01本頁面
【正文】 劑的溶液中，以防聚集，然后用環(huán)糊精除去表面活性劑，促進(jìn)折疊復(fù)性。分子伴侶和折疊酶不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。它可與待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)離活性中心的疏水區(qū)域結(jié)合，有效阻止無活性聚集體的形成。如胰島素生長(zhǎng)因子 I的復(fù)性，除了在復(fù)性液中加入 Cu2+和Mg2+、 2mol尿素、鹽類（ 1mol/L NaCl、 DTT）外，還加入乙醇、甘油等。 5. 多離子化合物，如肝素，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，且有穩(wěn)定蛋白質(zhì)天然構(gòu)型的作用。如 Chaps、 Triton X100、磷脂、十二烷基麥芽糖苷、磺酸甜菜堿等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用。認(rèn)為 PEG的作用與分子伴侶的作用機(jī)理相似。天然蛋白質(zhì)即由第二個(gè)中間體形成。濃度為 ~可大幅度提高折疊效率（使不正確折疊和二硫鍵不穩(wěn)定）。 2. 對(duì)于某些需要輔因子才表現(xiàn)活性的蛋白質(zhì)，輔因子、配基、或底物具有很好促進(jìn)折疊的作用。 聚集反應(yīng)抑制劑的種類： 1. 可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍或尿素，以及一些離液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺類化合物等。 例：人 ?干擾素的后處理工藝 發(fā)酵液 離心 (發(fā)酵液冷卻至 10?C以下 ， 4000r/min離心 10min) 菌體 細(xì)胞破碎 (1倍體積細(xì)胞 +10倍體積 PBS buffer, 冰浴超聲破碎 5次 , 30s/次 , 4000r/min離心 30min)， 洗滌 (% Triton X100溶液 ， 1000r/min離心 20min， 重復(fù)三次 ) 包涵體提取變性 (包涵體 +8M 尿素 pH 50mM TrisHCl buffer mM EDTA, 10mM DTT室溫?cái)嚢?2h, 離心 (15000r/min, 30min) 例：人 ?干擾素的后處理工藝 變性蛋白液 稀釋 (取 1份變性液 +99份上述 buffer(不含 DTT與尿素 )， 使尿素終濃度小于 ， 4?C下攪拌 24h） 復(fù)性液 濃縮 (用截留 10kDa的超濾器濃縮 100倍 )， 透析后離心(15000r/min離心 30min) 濃縮上清液 Sephacryl s200柱層析分離：層析柱 2?100cm， pH 50mM TrisHCl buffer 平衡洗脫 稀釋 \透析 \超濾 復(fù)性法 折疊促進(jìn)劑協(xié)助復(fù)性法： 表面活性劑、 PEG、 分子伴侶 等 反相膠團(tuán)復(fù)性法、雙水相體系復(fù)性法 層析折疊復(fù)性（固相復(fù)性）： 凝膠過濾層析（ GF）、親和層析（ AFC） 、離子交換層析（ IEC） 、疏水層析（ HIC）等 蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制 復(fù)性中最重要的是抑制復(fù)性過程的聚集反應(yīng)。 溫度過高，蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重，低溫下聚集和折疊反應(yīng)都很慢，隨著溫度的上升二者的速度都加快 →常在室溫下進(jìn)行 6）折疊促進(jìn)劑 能夠促進(jìn)蛋白再折疊的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為折疊促進(jìn)劑，折疊促進(jìn)劑的作用原理在于穩(wěn)定復(fù)性蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、抑制肽鏈間的疏水相互作用。 5） pH和溫度 最適宜的復(fù)性 pH值應(yīng)大于 （ 一般 ），以防止自由 SH的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的 SS的形成。 ? 由于 I向 N轉(zhuǎn)化是一個(gè)慢的過程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在此時(shí)放置較長(zhǎng)的一段時(shí)間， I就可以慢慢地向 N轉(zhuǎn)化 ? 4）氧化還原環(huán)境 ? 復(fù)性不僅要降低或去除變性劑，同時(shí)必須提供 SH氧化形成 SS的環(huán)境 → 合適的氧化還原環(huán)境 ? 采用 配對(duì)的氧化型和還原型巰基物質(zhì) ? 配對(duì)低分子量巰基試劑包括 GSSG/GSH、半胱氨酸或巰基乙醇 /胱氨酸等。 →復(fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度宜低 （低濃度時(shí)，獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性效率比高濃度要好的多） 濃度過低又給后處理帶來不便 ，一般選擇 10－ 100μg／ ml，以避免分子間相互作用力引起聚集。 →復(fù)性過程中， 抑制肽鏈間的疏水相互作用 以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。 為將包涵體充分溶解，需加入還原劑 （如二硫蘇糖醇 DTT、 GSH、 β－巰基乙醇 βME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是 50100mM βME或 DTT（對(duì)于 目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵的有時(shí)也應(yīng)使用還原劑 ，因?yàn)?含 SS的雜蛋白 會(huì)影響包涵體的溶解） ? 加入 金屬螯合劑，如 EDTA，用來螯合 Cu2+、 Fe3+
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