【正文】 流式細(xì)胞術(shù) 之 結(jié)果形式 散點圖 直方圖 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 應(yīng)用領(lǐng)域 細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 遺傳學(xué)應(yīng)用 臨床應(yīng)用 科研應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù) 之 細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 細(xì)胞大小 細(xì)胞粒度 細(xì)胞表面面積 核漿比例 DNA含量與細(xì)胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量 染色體分析 細(xì)胞表面 /胞漿 /核的特異性抗原 細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 酶活性 激素結(jié)合位點 細(xì)胞受體 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞功能 在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選 流式細(xì)胞術(shù) 之 遺傳學(xué)應(yīng)用 細(xì)胞 DNA, RNA 含量的測定 染色體倍體分析 染色體分離 基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究 基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng) 基因表達(dá)調(diào)控研究 細(xì)胞內(nèi)基因定位 酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選 報告基因的定性定量檢測 植物遺傳學(xué)研究 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 臨床應(yīng)用 HIV免疫分型 ， CD4絕對計數(shù) 白血病和淋巴瘤的免疫分型 腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析 網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù) 細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測 干細(xì)胞計數(shù) 殘量白血病細(xì)胞檢查 HLAB27檢查 血小板功能及相關(guān)疾病 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 科研應(yīng)用 免疫功能研究 癌癥病人的多藥耐藥性 細(xì)胞動力學(xué)功能研究 動物性別篩選 海洋與環(huán)境微生物分析 染色體分選 流式細(xì)胞術(shù) What can Flow Cytometer tell us about a cell? 細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）、細(xì)胞分裂 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞散射光 、 熒光吸收 、 凋亡蛋白 、 線粒體功能 、鈣離子流和 pH值變化 、 DNA 鏈的斷裂 、 DNA含量 免疫功能 免疫細(xì)胞亞群 、 細(xì)胞因子 、 磷酸化 端粒長度 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分選 總結(jié) 免疫熒光法 √ 4 流式細(xì)胞術(shù) √ 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗證 實驗原理 、 操作步驟 、 注意事項 、 主要用途 www.themegallery.com 謝謝大家的關(guān)注 ！ 。 許多原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞系 ， 都為貼壁型生長 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 其他類型細(xì)胞： 在組織中提取細(xì)胞通常使用 酶消化法 。 其他標(biāo)本： 通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用酶進(jìn)行消化 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 從組織獲取淋巴細(xì)胞方法： 淋巴節(jié) 、 扁桃體 、 脾 、 胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松散 ， 容易分離成單個細(xì)胞 。 流式細(xì)胞術(shù) 之 實驗原理 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 實驗步驟 樣本處理 細(xì)胞計數(shù) 、 抗體染色 、 孵育 、溶血 、 固定 上機(jī)檢測 標(biāo)本準(zhǔn)備 ① ② ③ 自己完成 別人完成 + 抗體+ 支票 √ 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 樣本準(zhǔn)備 標(biāo)本來源： 外周血 、 骨髓 、 組織塊 、 培養(yǎng)細(xì)胞 、脫落細(xì)胞及其他 。 研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征 ，并加以定量 。 免疫熒光法 之 主要用途 免疫熒光法 免疫熒光法 √ 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗證 一 1 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 簡介 流式細(xì)胞術(shù) （ Flow Cytometry, 簡稱 FCM） 是一種可以快速 、 準(zhǔn)確 、 客觀 ， 并且同時檢測單個微粒 （ 通常是細(xì)胞 ） 的多項特性的技術(shù) ， 同時可以 對特定群體加以分選 。 特點： 較直接法靈敏； 標(biāo)記一種抗體鑒定多種抗原 。 應(yīng)用：基本不用了 ??！ 免疫熒光法 2． 間接法 熒光素 標(biāo)記 在 二抗 上 （ 二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的 IgG抗體 ） 。 1. 直接法 優(yōu)點 ：簡單 ， 時間短 ， 特異性強(qiáng) 。 免疫組化法 免疫 組化 法與免疫 印跡 法比較 項目 方法 一抗 定位 定量 假陽性 免疫組化 線性表位 構(gòu)象形表位 Yes 不能 精確定量 有 Western blotting 線性表位 No Yes No 免疫組化法 之 主要用途 免疫組化法 對目的蛋白進(jìn)行如下研究： 定位 定性 定量 棕黃色（陽性），細(xì)胞核 免疫熒光法 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 √ 免疫組化法 √ 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗證 一 1 免疫熒光法 根據(jù) 抗原抗體 反應(yīng) ， 把已知的 抗原或抗體標(biāo)記上 熒光素 ， 制成熒光抗原或抗體 ， 然后以它作為 探針 來檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)物質(zhì) 。 ② 溫柔沖洗 ， 防止切片的脫落 。 免疫組化法 之 注意事項 8. PBS的沖洗 免疫組化的染色過程 ， 除了前面的處理和加入抗體外 ， 都在 PBS的沖沖洗洗中度過 ， PBS沖洗的正確與否 ， 也是導(dǎo)致最后結(jié)果的關(guān)鍵 。 ， 純度較高 ， 特異性較強(qiáng) ， 不需要長時間的孵育 ， 也能夠結(jié)合得很好 。 免疫組化法 之 注意事項 7. 選擇合適的孵育時間 按說明書操作 。 免疫組化法 之 注意事項 ② 加入的抗體以一滴為佳 。 切片上 PBS存留過多 ， 將會稀釋加入的抗體 ，影響加入抗體的濃度 ， 同時也將影響最后的結(jié)果 ，如假陰性等 。 免疫組化法 之 注意事項 6. 手工操作時注意抗體的正確加入 ① PBS沖洗完畢后 ， 加入抗體 ， 如一抗 ， 二抗或三抗 。 在免疫組化染色前 ， 都必須對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行抑制 。 免疫組化法 之 注意事項 5. 徹底抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性 原因： 各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過氧化物酶 。 如果切片有鄒折 ， 染色后在鄒折的地方有深淺不一的顏色 ，這是一種假陽性 。 如果切片不平展 ， 免疫組化染色后 ， 可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象 ， 顏色深淺不一 。 對策： 取材要平整 、 外觀好看 、 大小厚度適中 。 如果取材太厚 ， 在較短的時間內(nèi)脫水不完全 ， 將可引起一系列的問題 ， 比如浸蠟不徹底 ，切片不好完成 ， 切不完整 。 對策： 對于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定 ， 有條件的應(yīng)將其剖開 ， 早取材 ， 早固定 。 另一種抗原彌散的方式就是 ， 由于組織沒有及時的固定所引起的 。 免疫組化法 免疫組化法 之 染色方法 根據(jù) 標(biāo)記物的不同 分為 免疫熒光法 免疫酶標(biāo)法 親和組織化學(xué)法 。 所以在進(jìn)行染色前 ， 需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露 ， 即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞 ，而 恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài) 。 其中 石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用 、 最基本的方法 ， 對于組織形態(tài)保存好 ， 且能作連續(xù)切片 ， 有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔 ， 供回顧性研究；是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法 。 多克隆抗體 是將純化后的抗原直接免疫動物后 ， 從動物血中所獲得的免疫血清 ， 是多個 B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物 。 免疫印跡法 膜上蛋白質(zhì)的 其他用途 氨基酸序列分析 作為抗原免疫動物制備抗體 免疫熒光法 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 √ 免疫組化法 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗證 一 1 免疫組化法 免