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蛋白質(zhì)研究方法ppt課件-展示頁

2025-01-27 11:36本頁面
  

【正文】 樣 510微升 , 就可以在 電泳時 、 電泳后或轉(zhuǎn)膜后觀察到非常清楚的蛋白條帶 。 通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳 ,或者可以根據(jù) 預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 的電泳情況 , 預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳 。 所以 , 加樣后 , 通過此濃縮過程 , 都能形成一狹窄的區(qū)帶 。 高電勢使蛋白質(zhì)和甘氨酸離子的移動速度加快 , 形成一個迅速移動界面 。 即 泳動速度為 Cl 蛋白 甘氨酸離子 。 電泳時 , 膠中的 Cl移動最快 , 電泳緩沖液中的甘氨酸 ( pI為 ) 在濃縮膠 , 故移動最慢 。 SDS 配膠的 Tris緩沖液 Tris甘氨酸電泳緩沖液 免疫印跡法 凝膠濃度(%) 線性分離范圍( KD) 15 1243 10 1668 3694 57212 凝膠濃度與蛋白分離范圍 免疫印跡法 濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理 在不連續(xù) SDSPAGE時 ,采用了兩種緩沖液濃度 、 pH值和凝膠孔徑 , 上層膠為 濃縮膠 ( 大孔徑 ) , 下層膠為 分離膠( 分子篩 ) 。 分子氧阻止鏈的延長 , 防礙聚合作用 。 Bis一定的情況下 , 總濃度越高 , 孔徑越小 。 所以 , 蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的分子質(zhì)量 。 SDS使蛋白的氫鍵 、 疏水鍵打開 , 并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上 , 形成蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 。 ) 管號 0 1 2 3 4 5 6 7 8 ddH2O 90 50 55 60 65 70 75 80 85 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 0 40 35 30 25 20 15 10 5 HCl 10 10 10 10 10 10 10 10 10 免疫印跡法 Western Blotting 實驗技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDSPAGE ( 2) 之 SDSPAGE Western Blotting 實驗技術(shù) 免疫印跡法 SDSPAGE 原理 蛋白質(zhì)進(jìn)行 PAGE時 , 其遷移率取決于所帶的凈電荷量以及分子的大小 、 形狀等因素 。 福林 酚法 ( Lowry法 ) : 蛋白質(zhì)中的酪氨酸 、 色氨酸 、半胱氨酸殘基與 Cu2+結(jié)合 , 生成復(fù)合物 , 進(jìn)而還原酚試劑的磷鉬酸 , 生成藍(lán)色化合物 , 用比色法測定 。 (上樣量 ) 其他商品化的試劑盒也可測蛋白含量 。 免疫印跡法 — 蛋白樣品的定量 紫外吸收法 :蛋白質(zhì)在 280nm左右有吸收高峰 ( 因色氨酸和酪氨酸的吸收 ) , 不同的蛋白 , 其中色氨酸和酪氨酸的含量各異 , 因此 A280值不同 。 重組蛋白的特點(diǎn) 免疫印跡法 Western Blotting 實驗技術(shù) 之 蛋白樣品的定量 生物化學(xué)所學(xué)的方法都可以 。 目的蛋白前加入信號肽序列 , 可使真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中 , 因其中的蛋白質(zhì)種類較少而使目的蛋白的分離純化得以簡化 。 離心的方法先收集包含體 , 再從中分離蛋白 。 重組蛋白的特點(diǎn) 免疫印跡法 包含體的形成 。 利用標(biāo)示物( tag) 的特性 , 用親合層析柱 , 可快速分離純化融合蛋白質(zhì) , 最后切除 tag即可 。 4. 通過層析或電洗脫法 、 色譜等制備目的蛋白 2DE 分離蛋白 免疫印跡法 —— 蛋白樣品的制備 病 毒 細(xì)胞 葉綠體 細(xì)胞膜 protein 2DE 鑒定 驗證 免疫印跡法 目的蛋白質(zhì)的量較多 , 至少占總蛋白量的 1%, 常為5%9%, 使純化易于進(jìn)行 。 免疫印跡法 —— 蛋白樣品的制備 聚乙二醇 ( PEG) 、 葡聚糖 ( DEX) 等溶于水中 ,蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)與多聚物分子中的氧或氫氧根結(jié)合 ,形成二者的復(fù)合體 , 從溶液中沉淀析出 。 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取 , 包括乙醇 、 丙酮和丁醇等 。 常用的中性鹽是硫酸銨 。 稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好 、 溶解度大 、 是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 抗原抗體之間特異的免疫反應(yīng) 。 免疫印跡法 Southern Blotting Northern blotting Western Blotting Eastern Blotting Southwestern blotting farwestern blotting 2D電泳分離蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)膜,特異的探針去檢測 SDSPAGE分離蛋白 ,轉(zhuǎn)膜 ,尿素去除 SDS,蛋白復(fù)性 ,特定 DNA探針檢測?;A(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 易發(fā)平 碩士生學(xué)位課程:蛋白質(zhì)組學(xué) 5 候選蛋白質(zhì)的驗證 個人簡介 血統(tǒng):正宗重慶人 —— 直爽 、 耿直 普通話:渝普話 —— 多多包涵 愛好:籃球 —— 切磋投籃 郵箱: 蛋白質(zhì) 酶解 肽的混合物 PMF 搜索引擎 Search engine 數(shù)據(jù)庫 搜索結(jié)果 驗證 蛋白質(zhì)組研究路線 RNAi實驗流程 免疫熒光法 授課內(nèi)容 4 流式細(xì)胞術(shù) 免疫印跡法 免疫組化法 1 2 3 1 候選蛋白質(zhì)的驗證 一 1 蛋白質(zhì)與生物大分子 相互的研究 二 下一講 免疫印跡法 blotting 實驗技術(shù) 印跡法 ( blotting) 是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上 , 而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法 。 1975年 , Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 ( NC膜 ) 上 , 并利用 DNA- RNA雜交檢測特定的 DNA片段的方法 ,稱為 Southern印跡法 。 與目標(biāo)蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)檢測 檢測對象是 DNA 檢測對象是 RNA 檢測對象是特定蛋白質(zhì) 檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾 檢測 DNA和蛋白質(zhì)相互作用 檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用 堿基互補(bǔ)配對 對象已知確定 對象未知 免疫印跡法 Western Blotting 實驗技術(shù) 之 基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體 , 然后用這種多肽的特異抗體來檢測 。 免疫印跡法 Western Blotting 實驗技術(shù) 之 一般流程 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 免疫印跡法 成功的要素 科學(xué)的對照 免疫印跡法 Western Blotting 實驗技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ( 1) 免疫印跡法 之 蛋白樣品的制備 Western Blotting 實驗技術(shù) 通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 針對水 、 稀鹽 、 稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì) 。 鹽析沉淀出的蛋白質(zhì)一般保持著天然構(gòu)象 。 細(xì)胞裂解液: 50 mmol/L TrisHCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 , % PMSF , 2μg/mL Aprotinin, Leupeptin , 免疫印跡法 —— 蛋白樣品的制備 蛋白質(zhì)處在一定量的有機(jī)溶劑中 , 分子間極性基團(tuán)的靜電引力增強(qiáng) , 水化作用降低 , 蛋白質(zhì)聚集而沉淀 。 該法沉淀蛋白質(zhì)的選擇性較高 , 不需脫鹽 。 改變多聚物的濃度可分段沉淀出不同的蛋白質(zhì) 。 可利用融合蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行純化 。 很多表達(dá)載體已帶有tag的 DNA序列 。 主要出現(xiàn)在大腸桿菌等原核生物中 , 溶解度很小的蛋白都進(jìn)入包含體中 , 包含體中的蛋白質(zhì)主要是外來性的重組蛋白 。 分泌蛋白質(zhì)的生成 。 大腸桿菌等有細(xì)胞壁的細(xì)胞可分泌至周質(zhì)中 , 收集細(xì)胞后 , 改變滲透壓 , 同時加入少量溶菌酶破壞細(xì)胞壁 , 提取周質(zhì)后 , 純化目的蛋白 。 凱氏定氮法 、雙縮脲法 、 福林 酚法和紫外吸收法 。 Bradford
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