【正文】 法 考馬斯亮藍(lán) G250有紅 、 藍(lán)兩種不同顏色的形式 ， 在一定濃度的乙醇和酸性條件下 ， 可配成淡紅色的溶液 ， 與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物 ， 該化合物在 595nm處有最大吸收值 ，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。 免疫印跡法 — 蛋白樣品的定量 凱氏定氮法： 蛋白質(zhì)中氮在濃硫酸作用下生成銨鹽 ， 與濃NaOH作用 ， 產(chǎn)生氨氣 ， 吸收于標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液中 ， 用標(biāo)準(zhǔn)酸直接滴定 ， 測出含氮量 ， 按蛋白質(zhì)恒定的含氮量 （ 16%） ，換算出蛋白的含量 。 免疫印跡法 — 蛋白樣品的定量 試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液 ， ， 雙蒸水 ， 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 （ 將10mg/ml蛋白溶液稀釋至 , , , , , , , 。 如在膠中加入 SDS和巰基乙醇后 ， 巰基乙醇使蛋白分子中的二硫鍵還原 。 大量的 SDS結(jié)合后 ，各種蛋白都帶上相同的負(fù)電荷 ， 大大超過了蛋白原有的電荷量 ， 因而原有的電荷差別可忽略 。 免疫印跡法 SDSPAGE 凝膠成份 丙烯酰胺和 N,N’亞甲雙丙烯酰胺 （ Bis） ?? 聚合而成的分子篩 ， 孔徑大小由二者的總濃度及Bis的濃度決定 。 免疫印跡法 SDSPAGE 凝膠成份 TEMED 過硫酸銨 （ APS） (時(shí)間 ) TEMED 及 APS激發(fā)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成 。 所以凝膠液需排氣 ， 在水或水飽合異丁醇隔絕空氣的條件下反應(yīng) 。 濃縮膠中的緩沖對(duì)為 TrisHCl， 電泳 Buffer的緩沖對(duì)為Tris甘氨酸 。 而 SDSProtein 在無分子篩效應(yīng)的大孔徑濃縮膠中移動(dòng)速度居第二 。 免疫印跡法 濃縮膠濃縮蛋白質(zhì)的原理 隨著電泳的進(jìn)行 ， Cl與后面的蛋白帶 之間形成電勢梯度 ， 同樣的 蛋白與甘氨酸離子 之間也會(huì) 形成電勢梯度 。 由于蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)度居第二 ，使 蛋白質(zhì) 聚集在這個(gè)移動(dòng)界面附近 ， 被濃縮成一狹窄的中間層 。 免疫印跡法 電泳時(shí)通常推薦在 上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳 ,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳 。 SDSPAGE 電壓設(shè)置 免疫印跡法 **預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 包含了從 19kD到 117kD共 6種純化的預(yù)染藍(lán)色蛋白質(zhì) ，可以直接使用 ， 無需煮沸 。 SDSPAGE 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白 免疫印跡法 1） 電壓 。 SDSPAGE 注意事項(xiàng) 免疫印跡法 SDSPAGE 注意事項(xiàng) 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （ 3） Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 轉(zhuǎn)膜 膜的選擇 尼龍膜 硝酸纖 維素膜 封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩 簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合 價(jià)格昂貴 價(jià)格便宜 特殊要求下的選擇 需要更高的蛋白結(jié)合率 （尼龍膜： 480181。g/cm2 ） 目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱 需要更大的機(jī)械強(qiáng)度 PVDF膜 蛋白結(jié)合量最高 ， 機(jī)械強(qiáng)度也高 ， 其上的蛋白可用染料染色也可免疫顯色 ， 但使用前需處理 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 轉(zhuǎn)膜方法 半干法 按：用緩沖液濕潤濾紙 3張 、 膜 、 凝膠 、 緩沖液濕潤濾紙 3張順序放置 ， 電轉(zhuǎn) 10－ 30min。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 轉(zhuǎn)膜方法 濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間 ， 浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中 ， 電轉(zhuǎn) 45min或過夜 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 轉(zhuǎn)膜后檢測 麗春紅 S染色 蛋白帶出現(xiàn)后 ， 于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜 ， 換水幾次 ， 脫色 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （ 4） 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 封閉 Why? 抗體 蛋白 膜 雜交信號(hào) 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 封閉 目的： 防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。 常用封閉物有脫脂奶粉和 BSA（ 稀釋于不同的緩沖液中 ） ， 但不同的抗原 抗體反應(yīng) ， 封閉條件均不相同 。 建議使用 casein（ 牛奶中的酪蛋白 ） 或 BSA做封閉 。 37℃ 一小時(shí) ， 4 ℃ 過夜 。 回收一抗溶液 ？ ?在 Western或免疫熒光染色等操作后 ， 請(qǐng)注意回收稀釋的抗體 。 稀釋后的抗體 ， 包括已經(jīng)使用過的稀釋抗體 ， 4℃ 保存 。如果在重復(fù)使用過程中發(fā)現(xiàn)抗體出現(xiàn)輕微混濁現(xiàn)象 ， 可以10000g離心 13分鐘 ， 取上清用于后續(xù)檢測 。 一抗雜交 一抗選擇 ?免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（ 又稱表位 ） ， 有些表位是線性的 ， 而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響 ， 天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制 ， 煮后變性會(huì)消失 。 一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間 。 但如果所識(shí)別的抗原表位被破壞 ， 則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ， 這也是單抗的缺點(diǎn)之一 。 一抗雜交 一抗選擇 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （ 6） 免疫印跡法 加入用封閉液配制的二抗 ， 搖床上緩慢搖動(dòng) ， 37℃ 一小時(shí) ， 4 ℃ 過夜 。 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 二抗雜交 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 二抗雜交 二抗算不算多余？一抗不能顯色嗎？ 一抗是特異性的 ， 常用單抗 。 一抗如果是鼠抗人的抗體 ， 二抗應(yīng)該是另一種動(dòng)物抗鼠的抗體 ， 而且 一抗和二抗的動(dòng)物種屬原則上不應(yīng)該相同 。 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 流程詳解 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （ 7） 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 ?辣根過氧化物酶法（ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） ?化學(xué)發(fā)光顯色法 (HRP) 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 底物顯色 在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對(duì)照 （ βactin，GAPDH ） ， 應(yīng)先上目的蛋白的一抗 、 二抗 ，顯色 、 壓片 、 洗片；漂洗以后 ， 再上內(nèi)對(duì)照的一抗 、 二抗 ， 顯色 、 壓片 、 洗片 。 ECL是一種增強(qiáng)顯色法 ， 靈敏度要高 ， 但顯色麻煩 ， 發(fā)表文章常用 。 這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有機(jī)溶劑 ， 對(duì)于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想 。 魯米諾在免疫測定中既可用作標(biāo)記物 ， 也可用作過氧化物酶的底物 。 注意：熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來越弱 。 B. Western blot I mRNA 數(shù)據(jù)分析 D. Col I蛋白數(shù)據(jù)分析 免疫印跡法 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 之 雜交結(jié)果的分析 Western blotting 可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子 ， 進(jìn)行定量和半定量分析 ， 但是不能定位 。 其一：信號(hào)必須穩(wěn)定 ， 保證不同時(shí)間點(diǎn)檢測都可以得到相同的結(jié)果；其二：信號(hào)的強(qiáng)弱必須與目標(biāo)蛋白深度成比例關(guān)系 。 熒光信號(hào)一經(jīng)激發(fā)出來就是穩(wěn)定的 ， 不隨時(shí)間變化；熒光強(qiáng)弱與目標(biāo)蛋白濃度成比例關(guān)系 （ 濃度越高 ， 結(jié)合的染料越多 ， 熒光信號(hào)越強(qiáng) ） ， 根據(jù)熒光強(qiáng)弱就可以對(duì)蛋白進(jìn)行精確的定量分析