【正文】 。 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差 ， 所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量 。 免疫組化定量分析 （ 半定量 ） ：用ＤＡＢ對免疫組化產(chǎn)物染色 ， 同時(shí)用蘇木對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染 。 根據(jù)細(xì)胞著色深度及陽性細(xì)胞數(shù) 分別記分為0～ 3 分 ,著色深度以多數(shù)細(xì)胞呈色程度為準(zhǔn) 。 免疫印跡法 Western Blotting 常見問題分析 Western Blotting 常見問題分析 不恰當(dāng)?shù)臉悠分苽鋾?huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗 新手采用含 TritonX100或 NP40的緩沖液裂解組織或細(xì)胞 ，結(jié)果無蛋白條帶 。 SDSPAGE上樣樣品中蛋白實(shí)際含量較低 。 同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適 SDSPAGE 不完美 Western Blotting 常見問題分析 SDSPAGE 不完美 條帶 9的形狀 ， 屬電泳條件比較合適的區(qū)帶 ，其余都是電泳條件不太理想所致 。 Western Blotting 常見問題分析 SDSPAGE 不完美 條帶呈笑臉狀 原因：凝膠不均勻冷卻 ， 中間冷卻不好 。 紋理 （ 縱向條紋 ） ：樣品中含有不溶性顆粒 。 Western Blotting 常見問題分析 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測 ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“ 三明治 ” 結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 Western Blotting 常見問題分析 一抗?jié)舛扔绊懡Y(jié)果 一抗?jié)舛忍?， 導(dǎo)致沒有特異帶 。 Western Blotting 常見問題分析 背景太高 protein protein 背景太高 背景較淺 對比度要好 。 對于一些背景較高的抗體 ， 可以在 4℃ 封閉過夜 。 Western Blotting 常見問題分析 DAB法顯色中常出現(xiàn)的問題及對策 (1)膜干燥之后 ， 區(qū)帶顏色變淺 ， 甚至看不見了 。 對策 ：如果為了照像 ， 可將膜浸濕 ， 增強(qiáng)信號 ， 但為 了根本解決問題 ， 還需增加點(diǎn)樣量 。 原因 ： ① 二抗反應(yīng)后 ， 膜洗得不干凈 ， 還有過量的過氧化物酶或堿性磷酸酶存在； ② 顯色液的溫度過高； ③ 顯色液或基質(zhì)的濃度過高 。 但是如果背景顏色已太深 ， 清晰的圖譜已難得到；② 將顯色液溫度降低之后 ， 再顯色； ③ 將顯色液中各成分的濃度降低 ， 重新配制 。 原因： 不是異常結(jié)果 ， 而是區(qū)帶的蛋白質(zhì)含量高 。 Western Blotting 常見問題分析 顯色中常出現(xiàn)的問題及對策 (4)顯色時(shí)間已足夠長 ， 但仍不見區(qū)帶出現(xiàn) ， 顯色液也澄 清不變色 。 對策： ① 檢查二抗是否有錯(cuò) ， 膜充分洗凈后 ， 用新配 制抗體反應(yīng)； ② 重新配制顯色液 。 原因 ： ① 一抗所對應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)不存在 ， 或量很少； ② 一抗和二抗都失活 ， 或二抗不能與一抗反應(yīng) 。 如結(jié)合反應(yīng)正 常 ， 最后測定抗體的效價(jià) 。 背景高掩蓋目的條帶 。 同一張膜用 TBST沖洗 ， 再改用另外公司的 ECL發(fā)光 ，曝光后成功 。 如是 DAB 顯色時(shí)間不要過長 ， 一般 2 分鐘足夠 。 5. 蛋白樣品降解或存在二聚體 。 免疫組化法 之 原理及定義 免疫組化法 免疫組化法 之 抗體 單克隆抗體 是一個(gè) B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體 ， 應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備 。 免疫組化法 免疫組化法 之 標(biāo)本來源 主要為 組織標(biāo)本 和 細(xì)胞標(biāo)本 兩大類 ， 前者包括石蠟切片 （ 病理大片和組織芯片 ） 和冰凍切片 ， 后者包括組織印片 、 細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片 。 免疫組化法 免疫組化法 之 標(biāo)本制作 U2Os細(xì)胞系 APE1 免疫組化染色 細(xì)胞爬片法 石蠟切片機(jī) 冰凍切片機(jī) 免疫組化法 免疫組化法 之 主要步驟 洗載玻片 包埋組織 切片 脫蠟 抗原修復(fù) 血清封閉 加一抗 加二抗 加顯色劑 復(fù)染 脫水 封片 免疫組化法 免疫組化法 之 抗原修復(fù) ？ 石蠟切片標(biāo)本均用 甲醛固定 ， 使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵 、羧甲鍵而被 封閉了部分抗原決定簇 ， 同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使 抗原決定簇隱蔽 。 常用的抗原 修復(fù)方法 有微波修復(fù)法 ， 高壓加熱法 ， 酶消化法 ， 水煮加熱法等 ， 常用的修復(fù)液是 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液 。 免疫組化法 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 1. 組織固定越新鮮越好 原因： 壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用 ， 可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì) ， 這是 抗原發(fā)生彌散 的一種方式 。 離體的組織不及時(shí)固定 ， 組織就會(huì)自溶 ， 抗原就會(huì)擴(kuò)散 ， 在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 2. 組織脫水必須徹底干凈 原因： 組織塊取材不能太大過厚 ， 才能較好地完成脫水的過程 。 導(dǎo)致后來切片染色的脫落 ， 造成染色的失敗 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 3. 切片必須完整 、 均勻 、 平展 、 無鄒折 原因： 切片完整 ， 平展 、 無汽泡 ， 無鄒折 ， 有利在染色時(shí)的沖洗 ， 有利于切片的牢固附貼 。 如果有汽泡切片在烘烤時(shí) ， 由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織 ，在其周圍可觀察到深淺不一的染色 。 免疫組化法 之 注意事項(xiàng) 4. 切片脫蠟必須干凈 原因： 如果脫蠟不干凈 ， 少許蠟存留于切片上 ， 將會(huì)引起許多弊病 ， 如染色不均勻 ， 陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn) ，真假難辨 ， 背景染色增加等 。含有這種酶的各細(xì)胞和組織如果在染色前不對其進(jìn)行處理和抑制 ， 它們將會(huì)在 DAB底物的顯色時(shí) ， 與HRP一樣催化底樣 ， 使之顯色 ， 生成與陽性物一樣的黃棕色 ， 即背景染色造成混亂 。 對策： 常用抑制劑是 %的 H2O2。 除去切片上多余的 PBS， 但不能讓切片干涸 。 切片干涸 ， 往往可產(chǎn)生非特異性染色 。 當(dāng)擦干組織塊周邊多余的 PBS后 ， 切片保持著一定的濕潤度 ， 此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候 ， 滴入抗體以 一滴 50ul為好 ， 加入后 ， 輕微 、 搖勻覆蓋于切片 上 ， 使最后的結(jié)果穩(wěn)定均衡 ， 不至于有的地方有反應(yīng) ， 有的地方無反應(yīng) 。 不主張于 4℃ 冰箱中過夜 ， 原因是： ， 或者被吸附 ， 造成背景的染色 。 ， 容易引起切片脫落 ， 造成染色的失敗 。 ① 單獨(dú)沖洗 ， 防止交叉反應(yīng)造成污染 。 ③ 沖洗的時(shí)間要足夠 ， 才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì) 。 免疫熒光法 之 原理 免疫熒光法 熒光抗體染色 熒光素直接 標(biāo)記 特異性抗體 （ — 抗 ） 上 ， 標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合 （ 在切片上 ） ,熒光顯微鏡下觀察→ 檢測抗原 。 缺點(diǎn)： 靈敏度低 ， 所需抗體量大 （ 不經(jīng)濟(jì) ） 。 顯色后鏡檢 。 免疫熒光法 1. 顯示目的基因的表達(dá)情況 免疫熒光法 之 主要用途 免疫熒光法 免疫熒光法 1. 顯示目的基因的表達(dá)情況 2. 基因定位 因?yàn)檩^高的敏感性可以顯示出基因表達(dá)的亞細(xì)胞情況 (核內(nèi) ， 核外 ， 膜上以及一些較大的細(xì)胞器上 )。 研究對象為生物顆粒 ， 如各種細(xì)胞 、 染色體 、微生物 、 及人工合成微球等 。 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 之 實(shí)驗(yàn)原理 單細(xì)胞 懸液 熒光信號 激光束 磷酸緩沖液 流式細(xì)胞術(shù) 熒光信號的 強(qiáng)度代表 了所測細(xì)胞膜表面 抗原的強(qiáng)度 或其 核內(nèi)物質(zhì)的濃度 。 標(biāo)本處理時(shí)間： 新鮮樣本分析時(shí) ， 樣本采集后應(yīng)立即分析 。 一般對樣本進(jìn)行切剪 、 研磨 、 過濾便可 。 對于不同標(biāo)本 ， 處理方法也各不相同 。 同樣對于不同組織處理方法也各異 。通常先用 胰酶處理獲得單細(xì)胞懸液 ， 需注意消化過度會(huì)損害細(xì)胞 ， 特別是改變其表面抗原標(biāo)記