蛋白質(zhì)復(fù)性ppt課件-閱讀頁
2025-05-18 06:01本頁面
【正文】 8mol/L Urea等）；在 中間濃度 時(shí)（ 較低濃度 的鹽酸胍和Urea），主要以 I存在，即能抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，又不會妨礙蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水相互作用的形成。通常還原型巰基物質(zhì)的使用濃度為 l~3mmol/L，還原型 /氧化型的摩爾比為 10： 1或 5： 1。 應(yīng)避免在蛋白質(zhì) pI處進(jìn)行復(fù)性（蛋白質(zhì)的靜電排斥力幾乎為零，相互間疏水作用區(qū)域就容易作用而形成 A）。 應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)性并具有顯著效果的折疊促進(jìn)劑有 表面活性劑、聚乙二醇 PFG、 L－精氨酸、抗體、分子伴侶 等。 最常用的是使用聚集反應(yīng)的抑制劑，其原理為： ? 穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)， ? 降低錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性， ? 增加折疊復(fù)性中間體的溶解度， ? 增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解度， ? 減少復(fù)性中間體接觸發(fā)生聚集反應(yīng)。在非變性濃度下，是很有效的促進(jìn)劑。 Zn2+ 和 Cu2+可穩(wěn)定折疊中間體。 3. PEG促進(jìn)折疊復(fù)性， PEG與復(fù)性中間體特異形成非聚集的復(fù)合物，阻止復(fù)性時(shí)疏水中間體的聚集，復(fù)合物折疊形成第二個(gè)中間體，并不再與 PEG結(jié)合。在有 PEG存在下的所有的折疊反應(yīng)具有相同的速率，復(fù)性率與 PEG的分子量及濃度相關(guān)。 4. 非離子型表面活性劑，尤其是離子型或兩性離子表面活性劑。不利是與蛋白質(zhì)形成膠團(tuán)，難以去除，影響后續(xù)的分離純化。 6. 短鏈醇類、高滲物，如乙醇、甘油等對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，可有效降低低聚體的形成。 7. 單克隆抗體，待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效的協(xié)助其復(fù)性，但只有該蛋白質(zhì)的特異抗體有效。 8. 分子伴侶和折疊酶，這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI)、肽酰 脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)、分子伴侶、 FK506結(jié)合蛋白、 Cyclophilin等。由于分子伴侶和折疊酶在蛋白質(zhì)復(fù)性后要除去，且這類蛋白質(zhì)又十分昂貴，須采用可回收的方法，如固定化方法。這稱為人工伴侶復(fù)性。 SS鍵的形成需要適當(dāng)?shù)难趸€原條件，對于稀釋復(fù)性法，最簡單的方法是通入空氣，進(jìn)行氧化形成 SS鍵，但氧化速度太慢；最常采用的是適當(dāng)比例的氧化還原對，如 GSH/GSSG,形成 SS鍵，或使錯(cuò)誤 SS鍵重排，促進(jìn)正確 SS鍵的形成。 多聚 Lys蛋白對肝素 瓊脂糖凝膠具有較強(qiáng)親和活性 吸 附 洗脫 固相復(fù)性的流程 柱上復(fù)性 變性劑去除 固相基質(zhì)：肝素 瓊脂糖凝膠 ? 由于凝膠基質(zhì)微孔的體積排阻效應(yīng)和減少的擴(kuò)散效應(yīng)，部分折疊的蛋白質(zhì)之間的相互作用受到有效的阻擋 ? → 降低了發(fā)生聚集的可能性 ? 可溶性的聚集物、復(fù)性的蛋白、變性劑和氧化還原劑依次流出 Using GF 凝膠過濾 固相復(fù)性（柱上復(fù)性）優(yōu)缺點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn)： 在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的，使復(fù)性和純化同時(shí)進(jìn)行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。 展 望 ? 研究蛋白質(zhì)變性復(fù)性機(jī)理，開發(fā)新的變性復(fù)性原理和技術(shù)，解決目前的技術(shù)關(guān)鍵。 ? 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)原理，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。 許多變性蛋白質(zhì)在去除變性因素后，可自發(fā)地恢復(fù)它原來的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這稱為變性蛋白質(zhì)的再折疊或復(fù)性。包涵體直徑約 ，具有很高的密度（約 mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。 2）添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的添加劑，如：培養(yǎng) （誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）等。 4）將目標(biāo)蛋白與親水蛋白、分子伴侶、折疊酶等共表達(dá)； 包涵體形成的幾種可能性 : 1）少量蛋白產(chǎn)生時(shí)是可溶的，表達(dá)量過高，積聚量超過其在細(xì)胞內(nèi)溶解度時(shí)沉淀； 2）合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對； 3）蛋白產(chǎn)生量過多，所需其他成分 (如折疊酶和一系列翻譯后修飾酶及分子伴侶等 )不足； 4）重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多、 Pro含量越高越容易形成包涵體。 6）豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。 2. 對于含有 SS的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。 ，如 EDTA，用來螯合 Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的 SH與之發(fā)生氧化
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