【正文】 78 蛋白質分子中離子鍵的形成 79 E14． 范德華氏 （ van der Waals)引力 ?原子之間存在的相互作用力 。 ? 維系蛋白質一級結構的主要化學鍵為肽鍵。 ? 蛋白質與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在 6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質。 Sanger由此 1958年獲Nobel 化學獎。 E2 蛋白質的一級結構 81 蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目 . ?多肽鏈的氨基酸順序， ?以及多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數目和位置。 82 ?胰島素 （ Insulin） 由 51個氨基酸殘基組成 ， 分為A、 B兩條鏈 。 A、 B兩條鏈之間通過兩個二硫鍵聯(lián)結在一起 ， A鏈另有一個鏈內二硫鍵 。 許多先天性疾病是由于某一重要的蛋白質的一級結構發(fā)生了差錯引起的 。 若 β 亞基 6位 Glu被 Lys取代引起另一類貧血：血紅蛋白 C病 。 84 細胞色素 c的一級結構與生物進化的關系 85 E3 蛋白質的三維結構 ?蛋白質的二級 (Secondary)結構 是指肽鏈的主鏈在空間的排列 ,或規(guī)則的幾何走向、旋轉及折疊。 ?主要有 a螺旋、 ?折疊、 ?轉角。 ， 稱為 肽單元或肽鍵平面 。 89 肽鍵平面 —— 由于肽鍵具有部分雙鍵的性質，使參與肽鍵構成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為 肽鍵平面或肽單元 。 ?肽鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的酰胺基團的 CO基與第四個氨基酸殘基酰胺基團的 NH基形成氫鍵。 a螺旋 93 a螺旋 94 ?影響 α螺旋穩(wěn)定的因素有： ⑴ 極大的 側鏈基團 如 Asn（ 天冬氨酸 ） 、 Leu（ 亮氨酸 ） 側鏈很大 ，防礙 α 螺旋的形成 。同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內 ,正電荷相斥 ,也防礙 α 螺旋的形成 。 95 E312 ?折疊 ??折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。一種為平行式，即所有肽鏈的 N端都在同一邊。 ?折疊 97 ?β 折迭包括平行式和反平行式兩種類型 98 β折迭： 99 E313 ?轉角 ?在 ?轉角部分，由四個氨基酸殘基組成 。 ?這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。 回折部分所形成的一種二級結構 ， 其結構特征為： ⑴ 主鏈骨架本身以大約 180176。 ⑵ 回折部分通常由四個氨基酸殘基構成 。 102 無規(guī)卷曲： ?無規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無規(guī)律的卷曲構象 。 ?蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成 一個有特殊功能的空間結構。 105 鋅指結構 (螺旋 折迭 折迭模序 ) 106 E32 蛋白質的三級結構 ?蛋白質的三級結構 是指蛋白質分子或亞基內所有原子的空間排布 ， 也就是一條多肽鏈的完整的三維結構 。 107 108 109 ?結構域： 在一級結構上相距較遠的氨基酸殘基，通過三級結構的形成，多肽鏈的彎折，彼此聚集在一起，從而形成一些在功能上相對獨立的，結構較為緊湊的區(qū)域，稱為 結構域（ domain）。有的蛋白質分子有一個結構域 ,有的有多個，如纖連蛋白含有 6 個結構域。 ?這種蛋白質分子中，最小的單位通常稱為亞基或亞單位 Subunit，它一般由一條肽鏈構成，無生理活性； 115 ?維持亞基之間的化學鍵主要是疏水力。 ?維系蛋白質四級結構的是 氫鍵 、 鹽鍵 、范氏引力 、 疏水鍵 等非共價鍵 。 116 117 血紅蛋白 (hemoglobin)的四級結構 118 119 蛋白質的一級結構 一級結構指肽鏈中氨基酸的排列順序，它決定了蛋白質的結構、性質和功能 。 血紅蛋白 是由 4條肽鏈組成 。 蛋白質的二級結構 二級結構是指多肽借助氫鍵排列成沿一維方向具有周期性結構的構象 。 蛋白質的四級結構 由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽鏈聚合成特定構象的蛋白質分子 ，又稱為寡聚蛋白，其中每一條多肽鏈稱為 亞基 ，亞基單獨存在時無活力性 . 維持四級結構的主要力量是 疏水力，還有范德華力、氫鍵、鹽鍵、二硫鍵等。 121 蛋白質四級結構與功能的關系 ——變構效應 當血紅蛋白的一個 α亞基與氧分子結合以后 ， 可引起其他亞基的構象發(fā)生改變 ， 對氧的親和力增加 ， 從而導致整個分子的氧結合力迅速增高 ， 使血紅蛋白的氧飽和曲線呈 “ S‖形 。 一個蛋白質與它的配體或其它蛋白質結合后 ， 蛋白質的構象發(fā)生變化 ， 使它更適合于功能需要 。 一個亞基與其配體結合后 ,能影響此寡聚體中一亞基與配體的結合能力。 ?血紅蛋白中，血紅素 Fe原子的第六配價鍵可以與不同的分子結合：無氧存在時，與水結合，生成去氧血紅蛋白 (Hb)；有氧存在時，能夠與氧結合形成氧合血紅蛋白 (HbO2)。這樣就可以消除由于呼吸作用產生的 CO2引起 pH的降低。 由于 CO與血紅蛋白結合的能力是 O2的 200倍， 因此，人體吸入少量的 CO即可完全抑制血紅蛋白與 O2的結合，從而造成 缺氧 死亡。 130 種屬差異 131 Section F Character of Protein F1 蛋白質水解 132 ?常用 6 mol/L的鹽酸或 4 mol/L的硫酸在105110℃ 條件下進行水解 ， 反應時間約20小時 。 缺點是 色氨酸 被沸酸完全破壞； ?含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基被水解成了羧基 。 ?由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞 ， 產率不高 。 ?該法的優(yōu)點是 色氨酸 在水解中不受破壞 。 ?應用酶水解多肽不會破壞氨基酸 ， 也不會發(fā)生消旋化 。 ?最常見的蛋白水解酶有以下幾種： F13酶水解 135 ? Trypsin ： R1=賴氨酸 Lys和精氨酸 Arg側鏈（專一性較強，水解速度快）。 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和組氨酸His水解稍慢。 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快 。 亮氨酸 Leu，異亮氨酸Ileu,蛋氨酸 Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。 F2 蛋白質的兩性解離與等電點 141 ?蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。 ?在不同的 pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。這種現象稱為蛋白質電泳 (Electrophoresis)。利用蛋白質的電泳現象，可以將蛋白質進行分離純化。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現象、布郎運動等。 （2）蛋白質的膠體性質 144 ?蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。 （3）蛋白質的沉淀作用 145 ?在溫和條件下，通過改變溶液的 pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。 ?可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。 ?由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。 （3）蛋白質的沉淀作用 不可逆沉淀 147 ?蛋白質的性質與它們的結構密切相關。這種現象稱為蛋白質的變性 (denaturation)。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。 ?蛋白質變性的可逆性： a)蛋白質在體外變性后，絕大多數情況下是不能復性的； b)如變性程度淺，蛋白質分子的構象未被嚴重破壞；或者蛋白質具有特殊的分子結構，并經特殊處理則可以復性。 ? 變性后的蛋白質由于疏水基團的暴露而易于沉淀 ， 但沉淀的蛋白質不一定都是變性后的蛋白質 。 因此 ， 凡凝固的蛋白質一定發(fā)生變性 。 ?這三種氨基酸的在 280nm 附近有最大吸收。 ?利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。 糖蛋白和脂蛋白 特點 蛋白質含量較多 ，糖所占比例變動大，表現為蛋白質的特性。乳糜微粒 90％是甘油三酯，其余為磷脂、蛋白質和膽固醇。 脂蛋白 ：脂 類分子與蛋白質結合成的化合物，其中脂類占有不同的比例，典型的如血漿脂蛋白。 血脂與血漿中的蛋白質結合形成水溶性復合物 LP形式存在和運輸 。主要成分是甘油三酯，磷脂和膽固醇含量比乳糜微粒多。與動脈粥樣硬化發(fā)病有關。低密度脂蛋白中膽固醇酯增多，甘油三酯顯著下降。故也有人把極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白稱為致動脈粥樣硬化脂蛋白。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。 再經離心或鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法制得蛋白質粗制品。 ?常用的中性鹽有： 硫酸銨 、氯化鈉、硫酸鈉等。 ? 鹽析沉淀蛋白質時，通常不會引起蛋白質的變性。 G1 鹽析 161 大量中性鹽如 (NH4)2SO Na2SO NaCl加入蛋白質溶液中 ,破壞蛋白質在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀 .各種蛋白質鹽析時需鹽濃度及 pH不同 . 半飽和硫酸銨 離心 球蛋白沉淀 血清 血清 離心 飽和硫酸銨 白蛋白沉淀 162 凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質。 G2 有機溶劑沉淀 163 透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。 164 ?帶電粒子在電場中移動的現象稱為 電泳 。 ?蛋白質與多肽一樣 ， 能夠發(fā)生兩性離解 ，也有等電點 。 G3 電泳 165 等電聚焦電泳 （ 見清華軟件 ） 聚丙烯酰胺凝膠中的緩沖液在電場作用下形成沿電場方向的 pH梯度 。 二維電泳 （雙向電泳） 一維方向用等電聚焦進行電泳，將不同等電點的蛋白質分開。所以雙向電泳可以將不同等電點和分子量的蛋白質分開。 ?主要的層析技術有離子交換層析 ， 凝膠層析 ， 吸附層析及親和層析等 。在帶電荷相同情況下 ， 極性大的氨基酸先被洗脫下來 。 氨基酸的洗脫順序與陽離子交換柱相反 。 （見清華軟件） 170 171 ?利用物質密度的不同 ， 經超速離心后 ， 分布于不同的液層而分離 。 ?利用物質密度的不同 ， 經超速離心后 ， 分布于不同的液層而分離 。 G5 超速離心 172 密度梯度離心法 沉降的速度與顆粒的重量 、 密度和形狀有關 。 再進行光學定位 ，針刺或冰凍切片采樣分