【正文】 N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 嗜熱菌蛋白酶 139 ?分別從肽鏈羧基端和氨基端水解 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點(diǎn) 羧肽酶和氨肽酶 140 ?由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和游離的羧基 ， 因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì) ，因而也具有特定的等電點(diǎn) 。 F2 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) 141 ?蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí) (Isoelectric point pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動(dòng)。 ?在不同的 pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳 (Electrophoresis)。 （1）蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象 142 電泳 ?蛋白質(zhì)在等電點(diǎn) pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。 143 ?由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。 ?由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 （2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 144 ?蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。 ?改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì) ?在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。 （3）蛋白質(zhì)的沉淀作用 145 ?在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱?pH或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 ?在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。 ?可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。 （3）蛋白質(zhì)的沉淀作用 可逆沉淀 146 ?在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 ?由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 ?如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。 （3）蛋白質(zhì)的沉淀作用 不可逆沉淀 147 ?蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性 (denaturation)。 （4）蛋白質(zhì)的變性 148 蛋白質(zhì)的變性 149 ?變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。 ?蛋白質(zhì)變性的可逆性： a)蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下是不能復(fù)性的； b)如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或者蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性。 150 核糖核酸酶的變性與復(fù)性 151 ? 蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為 沉淀 。 ? 變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀 ， 但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì) 。 ? 加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為 凝固 。 因此 ， 凡凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性 。 152 ?大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 ?這三種氨基酸的在 280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在 280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 ?利用這個(gè)性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。 （5）蛋白質(zhì)的紫外吸收 153 糖蛋白定義 一種或多種糖以共價(jià)鍵連接到肽鏈上的蛋白質(zhì)。 糖蛋白和脂蛋白 特點(diǎn) 蛋白質(zhì)含量較多 ，糖所占比例變動(dòng)大，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的特性。 細(xì)胞膜、溶酶體、細(xì)胞外液 分布 154 血漿脂蛋白包括： ① 乳糜微粒 (CM)。乳糜微粒 90％是甘油三酯，其余為磷脂、蛋白質(zhì)和膽固醇。乳糜微粒是一種食物來源的脂肪顆粒，主要含外源甘油三脂大約 90％，在幾種脂蛋白中顆粒最大，密度最低。 脂蛋白 ：脂 類分子與蛋白質(zhì)結(jié)合成的化合物，其中脂類占有不同的比例，典型的如血漿脂蛋白。 糖蛋白和脂蛋白 155 血脂與血漿脂蛋白 (lipoprotein ,LP) 血脂 血漿中所含脂類的總稱 ， 主要包括甘油三酯 、 磷脂 、 膽固醇 、 膽固醇酯及游離脂肪酸等 。 血脂與血漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成水溶性復(fù)合物 LP形式存在和運(yùn)輸 。 按密度大小依次為： 乳糜微粒（ CM） 極低密度脂蛋白（ VLDL) 低密度脂蛋白 (LDL) 高密度脂蛋白 (HDL） 密 度 血漿脂蛋白的分類 顆 粒 156 蛋白質(zhì) 磷脂 甘油三酯 膽固醇 Chylo：乳糜微粒 157 ② 極低密度脂蛋白 (VLDL)。主要成分是甘油三酯，磷脂和膽固醇含量比乳糜微粒多。主要由肝臟合成，其中內(nèi)源性甘油三脂約占 60％，顆粒比乳糜微粒小，密度比乳糜微粒略高。與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病有關(guān)。 肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙等是動(dòng)脈粥樣硬化形成的危險(xiǎn)因素 !!! 158 ③ 低密度脂蛋白 (LDL)。低密度脂蛋白中膽固醇酯增多，甘油三酯顯著下降。低密度脂蛋白是極低密度脂蛋白降解產(chǎn)物，顆粒比極低密度脂蛋白小，密度比它高，與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病有密切關(guān)系。故也有人把極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白稱為致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白。 159 Section G Isolated and Purification of Protein Isolation 一般的機(jī)械方法不能破壞細(xì)胞。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。 超聲細(xì)胞破碎儀 細(xì)胞破碎系統(tǒng) 水溶性蛋白質(zhì)用中性緩沖溶液抽提； 酸（堿）性蛋白質(zhì)用稀堿（酸）溶液抽提； 脂溶性蛋白質(zhì)用有機(jī)溶劑抽提。 再經(jīng)離心或鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法制得蛋白質(zhì)粗制品。 160 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽 ， 以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ， 使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出 ， 稱為 鹽析 。 ?常用的中性鹽有： 硫酸銨 、氯化鈉、硫酸鈉等。 ? 鹽析時(shí)，溶液的 pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好。 ? 鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。 ?分段鹽析 半飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白 。 G1 鹽析 161 大量中性鹽如 (NH4)2SO Na2SO NaCl加入蛋白質(zhì)溶液中 ,破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀 .各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)需鹽濃度及 pH不同 . 半飽和硫酸銨 離心 球蛋白沉淀 血清 血清 離心 飽和硫酸銨 白蛋白沉淀 162 凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀原理 ： ① 脫水作用 ② 使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。 G2 有機(jī)溶劑沉淀 163 透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。 超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。 164 ?帶電粒子在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為 電泳 。 ?不同的蛋白質(zhì)分子所帶 電荷量 不同 ， 且 分子大小 也不同 ， 故在電場中的移動(dòng)速度也不同 ， 據(jù)此可互相分離 。 ?蛋白質(zhì)與多肽一樣 ， 能夠發(fā)生兩性離解 ，也有等電點(diǎn) 。 在等電點(diǎn)時(shí) (Isoelectric point pI)， 蛋白質(zhì)的溶解度最小 ， 在電場中不移動(dòng) 。 G3 電泳 165 等電聚焦電泳 （ 見清華軟件 ） 聚丙烯酰胺凝膠中的緩沖液在電場作用下形成沿電場方向的 pH梯度 。當(dāng)具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在其中電泳時(shí) ， 每種蛋白質(zhì)移至與它的 pI 相一致的 pH處 ， 達(dá)到分離的目的 。 二維電泳 （雙向電泳） 一維方向用等電聚焦進(jìn)行電泳，將不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分開。再在垂直方進(jìn)行 SDSPAGE電泳，將不同分子量的蛋白質(zhì)分開。所以雙向電泳可以將不同等電點(diǎn)和分子量的蛋白質(zhì)分開。 166 ?層析 （ chromatography)是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異 ， 在相互接觸的兩相 （ 固定相與流動(dòng)相 ） 之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法 。 ?主要的層析技術(shù)有離子交換層析 ， 凝膠層析 ， 吸附層析及親和層析等 。 G4 層析 167 陽離子交換柱時(shí) ， 氨基酸的洗脫順序一般按酸性 、 中性 、 堿性氨基酸的順序先后被洗脫 。在帶電荷相同情況下 ， 極性大的氨基酸先被洗脫下來 。 陰離子交換樹脂含有堿性基團(tuán) [ 如一N(CH3)+3， OH]， 堿性基團(tuán)解離出的 OH—離子可以和溶液里的陰離子 (如氨基酸陰離子 )發(fā)生交換 ， 然后被洗脫 。 氨基酸的洗脫順序與陽離子交換柱相反 。 168 169 凝膠色譜法 將樣品流過用多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒（交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺）填裝的柱子，樣品中大分子不易進(jìn)入孔中，最先流出柱子。 （見清華軟件） 170 171 ?利用物質(zhì)密度的不同 ， 經(jīng)超速離心后 ， 分布于不同的液層而分離 。 ? 超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量 ，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù) S成正比 。 ?利用物質(zhì)密度的不同 ， 經(jīng)超速離心后 ， 分布于不同的液層而分離 。 ? 超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量 ，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù) S成正比 。 G5 超速離心 172 密度梯度離心法 沉降的速度與顆粒的重量 、 密度和形狀有關(guān) 。 離心后按其沉降的速度不同 ， 彼此分開形成區(qū)帶 。 再進(jìn)行光學(xué)定位 ，針刺或冰凍切片采樣分析 。