核酸的制備與提取ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 00:31 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 核酸的保存與鑒定 保持核酸分子結(jié)構(gòu)的完整性； 盡量清除其它分子的污染 ， 保證核酸純度； 應(yīng)盡量簡(jiǎn)化分離純化步驟 ， 縮短提取時(shí)間 盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞 第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則 一、核酸分子提取的技術(shù)路線 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) （一）核酸的釋放 細(xì)胞破碎的方法 機(jī)械法 高速組織搗碎機(jī) 玻璃勻漿器 研缽 物理法 超聲勻漿器 凍融法 化學(xué)法 自溶法 酶處理 表面活性劑處理法 （二）核酸的分離與純化： 應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分 非核酸的大分子污染物：蛋白質(zhì)、多糖及脂類 物質(zhì)等 非需要的核酸分子：分離某一特定的核酸分子 時(shí) ， 其它的核酸分子皆為雜質(zhì)； 加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子 （三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 沉淀 是濃縮核酸的最常用的方法 ? 常用的 鹽類 有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂 ? 常用的 有機(jī)溶劑 則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇 ? 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用 70%～75%的乙醇洗滌去除 二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì) 破碎細(xì)胞 核酸從細(xì)胞中游離出來(lái) 沉淀核酸 除去蛋白質(zhì) 乙醇 酚和氯仿 核酸的提取過(guò)程 基因組 DNA的特點(diǎn)： 1. 分子大，容易斷裂 DNA 分離純化方法： 第二節(jié) 真核基因組 DNA的分離純化 DNA酚抽提法示意圖 一、酚抽提法 基因組 DNA的提取 酚抽提法 樣品的準(zhǔn)備 細(xì)胞的裂解 蛋白質(zhì)變性 DNA的抽提 DNA的沉淀 血基因組 DNA試劑盒 酵母基因組 DNA試劑盒 細(xì)菌基因組 DNA試劑盒 細(xì)胞基因組 DNA試劑盒 DNA柱層析法示意圖 第三節(jié) 質(zhì)粒 DNA的提取與純化 ? 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子其大小范圍從 lkb至 200kb以上不等已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。 ? 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 質(zhì)粒特性 1. 分子相對(duì)小 2. 含有高效的自主復(fù)制成分 3. 不相容性 4. 轉(zhuǎn)移性 5. 選擇的標(biāo)記 6. 限制性內(nèi)切酶單一切。 質(zhì)粒 DNA的提取和純化 1．細(xì)菌的培養(yǎng) 先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒 DNA也在自主復(fù)制。 質(zhì)粒 DNA的小量制備 25ml 質(zhì)粒 DNA的大量制備 500ml { 2．細(xì)菌的收集 ? 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中 ， 排出大量代謝產(chǎn)物 ， 為了提高質(zhì)粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ， 細(xì)菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ， 漂洗 l2次 ， 離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈 堿裂解法 煮沸法 SDS裂解法 Triton溶菌酶法 3．細(xì)菌的裂解 方法 4．質(zhì)粒 DNA的提取 適用于大質(zhì)粒 DNA 不適宜含糖高的菌株如 HB101 ? 選擇性地使用 RNase的變性劑 （ 如酚 、 氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑 ） ? 設(shè)置專門 RNA移液裝置； ? 使用蛋白酶 K和陰離子去污劑如 SDS、 十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉 。 ? 準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú) RNA酶的器皿 ,DEPC處理水等 。 一、 RNA制備的條件與環(huán)境 第四節(jié) 真核細(xì)胞 RNA的分離純化 細(xì)胞 RNA的含量 每個(gè)細(xì)胞的 RNA量約為 105 μg 80%85% rRNA 10%15% tRNA 1%5% mRNA 其他 RNA： hnRNA、 snRNA 、 snoRNA… ? 核酸的鑒定 ? 濃度鑒定 ? 純度鑒定 ? 完整性鑒定 ? 核酸的保存 ? DNA的儲(chǔ)存 ? RNA的儲(chǔ)存 第五節(jié) 核酸的鑒定與保存 一、核酸的濃度鑒定 （ 1） 紫外分光光度法 ： 該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長(zhǎng)為 260nm。 DNA或 RNA的定量， OD260= ? 50μg/ml雙鏈 DNA ? 40μg/ml單鏈 DNA（或 RNA） ? 20μg/ml寡核苷酸 濃度鑒定 紫外分光光度法：測(cè)定 DNA在 A260nm的光吸收值 。 如計(jì)算 DNA
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