dna和rna的提取與純化-資料下載頁(yè)
2025-05-11 21:22本頁(yè)面
【正文】 結(jié)構(gòu)可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 也呈莖環(huán)結(jié)構(gòu) 大腸桿菌 5S rRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型 rRNA分子 大腸桿菌 5S rRNA 的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型 rRNA分子 mRNA分子 原核生物和真核生物的 mRNA在結(jié)構(gòu)上有所不同： 1) 原核生物的 mRNA是多順反子的 ， 真核生物的mRNA是單順反子的； 2) 原核 mRNA 539。端無(wú)帽子結(jié)構(gòu) ， 真核 mRNA 539。端有一段帽子結(jié)構(gòu) （ m7GpppNmpNmp） ； 3) 原核 mRNA 339。端無(wú) PolyA，真核 mRNA 339。端有PolyA。 mRNA分子 ?含量少，單鏈分子大小不一，也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 ?mRNA是蛋白質(zhì)生物合成的模板。 ?每一種蛋白質(zhì)都有對(duì)應(yīng)的 mRNA，種類多。 真核生物 mRNA的分離 （ 1)得到總 RNA后， 可用 oligo(dT)纖維素層析法提取mRNA[poly(A)+RNA ]. 其原理是大多數(shù)真核 mRNA 3’端帶有足夠長(zhǎng)的多聚腺苷酸殘基，可通過其與掛有寡聚 d(T)的纖維素親和形成穩(wěn)定的 RNA－ DNA雜合鏈，不含 polyA的 RNA從介質(zhì)中洗去后，應(yīng)用低鹽緩沖液解離雙鏈結(jié)構(gòu)，并從介質(zhì)中洗脫poly(A)+RNA, 從而使 mRNA得以純化。這些相異的mRNA分子合起來(lái)，實(shí)際上編碼了細(xì)胞內(nèi)所有的多肽。有柱層析的方法和批量層析兩種。 （ 2)提取 mRNA的另一種方法是包被抗生素蛋白鏈菌素的聚乙烯磁珠法 其優(yōu)點(diǎn)是可以直接從含異硫氰胍的裂解液中分離 mRNA。 在典型的實(shí)驗(yàn)中 ， 組織 、 細(xì)胞或細(xì)胞懸液用硫氰胍裂解 ，將帶生物素的 oligo（ dT） 引物直接加入裂解液 ， 放置一段時(shí)間 ， 使引物與細(xì)胞 mRNA poly(A)尾雜交 ， 然后加入交聯(lián)抗生素蛋白鏈菌素的磁珠 。 抗生素蛋白鏈菌素抓住帶生物素的oligo(dT)+復(fù)合物 ， 使它們附于磁珠上 ， 然后用磁體將磁珠從裂解液中回收 ， 以便用 高鹽溶液洗滌磁珠 。 最后 ， 用水將poly(A)+mRNA 從磁珠上洗脫 ， 用乙醇沉淀收集 。 用磁珠法獲得的 poly(A)+mRNA與傳統(tǒng)的 oligo(dT)纖維素層析相當(dāng)或更多 。 最大的優(yōu)點(diǎn)是操作快 ， 配體結(jié)合僅需幾分鐘 ， 磁力分離只需幾秒鐘 ， 洗滌和洗脫在大多數(shù)時(shí)候僅需 5min或更短的時(shí)間完成 。 但磁珠法有兩個(gè)最大的問題： （ 1） 一次只能處理最多 1g組織或細(xì)胞 ， （ 2） 磁珠昂貴 。 三 、 核酸濃度純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 廣泛用于測(cè)定制備物中核酸的質(zhì)量的方法有兩類。 1若樣品較純時(shí) ， 可通過分光光度法測(cè)定堿基吸收紫外線的量 ， 既簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確 。 其原理是由于核酸是在 260nm處有強(qiáng)吸收的化合物 。 常用 260nm和 280nm處吸收光度的比值檢查 DNA和RNA制品中蛋白類雜質(zhì)的污染程度。 由于 DNA和 RNA的比吸光系數(shù)均受溶液中離子強(qiáng)度和PH值的影響，因此只有在仔細(xì)控制 PH值且離子強(qiáng)度較低時(shí)才能測(cè)定準(zhǔn)確。溶液體積小時(shí)吸光度難以測(cè)定。該方法僅在很窄的濃度范圍內(nèi)可靠（ 5－ 90μl/ml）。 定量： 一般根據(jù) 260nm處的讀數(shù)可計(jì)算出樣品中的核酸濃度 ， 1 個(gè) OD值相當(dāng)于約 50μ g ／ ml雙鏈 DNA、 40μ g ／ ml單鏈DNA和 RNA及 33μ g ／ ml單鏈寡核苷酸 。 純度： DNA和 RNA純制品的 OD260： OD280值分別為 和 ， 若樣品中蛋白或酚的污染嚴(yán)重則 OD260： OD280較低 。 OD260／ OD230應(yīng)大于 ， 在 230處的強(qiáng)吸收則提示污染有酚鹽離子 ， 硫氰酸鹽或其他有機(jī)化合物 。 對(duì)于 DNA制備 ， 如果OD260／ OD280大于 RNA污染 。 小于 白質(zhì)或酚污染 。 OD260／ OD230 小于 ， 表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì) ， 如核苷酸 、 氨基酸 、 酚等 。 純的 RNA溶液 OD260： OD280的比值應(yīng)介于 ， OD260／ OD230應(yīng)大于 。 RNA樣品 OD260／ OD280的比值小于 ， 說(shuō)明有蛋白質(zhì)或苯酚污染 。 比值大于 ， 則可能被異硫氰酸胍等污染 。 OD260／ OD230小于 ， 表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì) 。 2若樣品中 DNA或 RNA含量較低或含有較多的雜質(zhì) ， 則可通過溴化乙錠或 Hoechst33258發(fā)出的熒光估測(cè)核酸含量 。 （ 不常用 ， 如需要可查 《 分子克隆 》 ） 3 DNA質(zhì)量的電泳測(cè)定 在一般分子標(biāo)記試驗(yàn)時(shí)要通過瓊脂糖電泳結(jié)合分光光度分來(lái)對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè) 。 植物總 （ 核 ） DNA樣品在瓊脂糖電泳時(shí)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶 ， 如果有拖尾情況 （ 即溴酚蘭前有彌散的熒光區(qū)出現(xiàn) ） 則表明樣品中存在著 RNA雜質(zhì) ， 如果電泳時(shí)不能形成清晰的條帶 ， 而只是彌散一片 ， 則表明 DNA已嚴(yán)重降解 ， 提取失敗。 在抽提質(zhì)粒 DNA過程中，由于各種因素的影響， 使超螺旋 (SC)的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒 DNA的 一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀 (OC)分子，如果兩條鏈 發(fā)生斷裂則形成線狀 DNA(L)分子 . 三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率，在一般情況下， 超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最 慢的為開環(huán)狀分子。 4 DNA質(zhì)量的酶切檢測(cè) 對(duì)于需要進(jìn)行酶切試驗(yàn) ， 如果必要的話 ， 還要進(jìn)行酶切檢測(cè) 。 方法：取 2μg DNA, 用 10單位 (U)HindⅢ 酶切過夜 , % agarose膠上電泳 , 檢測(cè)能否完全酶解
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