dna和rna提取原理和方法-資料下載頁
2025-05-11 21:22本頁面
【正文】 常見問題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實驗效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細胞或組織： ? 裂解液的質(zhì)量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 。 建議在液氮條件下將組織碾碎 ， 并且勻漿時使用更多裂解液 。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 。 樣品要相對小一點； ? 先用液氮研磨 ， 再加裂解液勻漿； ? 樣品與裂解液充分接觸前避免融化 ， 研磨用具必須預(yù)冷 ， 碾磨過程中及時補充液氮 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。 ? 設(shè)備限制： ? 測定 OD260 及 OD280 數(shù)值時 ， 要使 OD260 讀數(shù)在 之間 。 此范圍線性最好 。 ? 用水稀釋樣品： ? 測 OD 時 ， 對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。 用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低 。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開。 ? 變性電泳條帶變淡： ? EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； ? 甲醛的質(zhì)量不高 。 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產(chǎn)物 RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解 RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級結(jié)構(gòu) 將 RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度 反轉(zhuǎn)錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過 1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設(shè)計較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應(yīng)的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴增級 DNaseⅠ 處理 RNA 設(shè)計在 339。端沒有互補序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題三： 產(chǎn)生彌散（ smear）條帶 ? 第一鏈產(chǎn)物的含量過高 ? PCR反應(yīng)中引物過多 ? 循環(huán)數(shù)過多 ? 退火溫度過低 ? 寡核苷酸片段產(chǎn)生的非特異性擴增 常規(guī) PCR步驟中減少第一鏈產(chǎn)物的量 減少引物的用量 減少 PCR的循環(huán)次數(shù) 提高退火溫度 提取高質(zhì)量 RNA，防止被 DNA污染 可能原因 解決方案 謝謝！ 北京天為時代科技有限公司 // 本公司產(chǎn)品江蘇地區(qū)特約代理商 南京天為生物科技有限公司 聯(lián)系電話： 02586073713 84705301 84701501 24小時訂貨熱線： 13057585177 聯(lián)系人：王彤 免費技術(shù)支持： 800 810 2177
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