核酸提取原理及方法-資料下載頁
2024-12-08 10:17本頁面
【正文】 污染 /苯酚殘留 —— 加入氯仿后徹底混勻，并且離心分層的離心力 和時(shí)間要足夠。 —— 不要吸入中間層及有機(jī)相，寧愿多損失些上清。 —— 減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。 解決辦法 :重新抽提一次，再沉淀、溶解。 2022年 7月 RNA提取常見問題分析 ? 電泳帶型異常 ?上樣量超過 3μg ?電壓超過 8V/cm ?電泳緩沖液陳舊 均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開 2022年 7月 一． 核酸簡介 二． 基因組 DNA提取 三． 質(zhì)粒 DNA提取 四． 真核細(xì)胞總 RNA提取 五． 瓊脂糖凝膠電泳 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 ： DNA分子在高于其等電點(diǎn)的 pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。而瓊脂糖凝膠具有分子篩作用，不同分子量或分子形狀的核酸，其移動(dòng)速度有差異。因此，利用這種“ 電荷 ”和“ 分子篩 ”的雙重效應(yīng)，達(dá)到分離核酸的目的。 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 2. 瓊脂糖凝膠分離 DNA的范圍 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 A:EB 溴化乙錠 (Ethidium Bromide, EB） 可以嵌入核酸雙鏈的堿基對之間 ， 在紫外線激發(fā)下 ， 發(fā)出紅色熒光 。 EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便 ， 快速 ， 室溫下 1520min； 不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高 ， 10ng或更少的 DNA即可檢出；可以直接加到樣品中或膠中；價(jià)格低廉 。 EB是誘變劑 ， 使用時(shí)一定要戴手套 。 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄 。 2022年 7月 B：新型 低毒染料 ： 如 Gold View、 SYBR GreenⅠ 、 SYBR Gold等。 毒性較低，但價(jià)格較昂貴。 靈敏度較好，但不如 EB。 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 （ 1%， 50 ml） 稱取 g瓊脂糖，置于 250 ml錐形瓶中，加入60 ml 1 TAE電泳緩沖液，微波爐中加熱，使瓊脂糖溶解。一般需反復(fù)煮沸 3次，瓊脂糖才能充分溶解。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)； 待膠液冷卻至 60℃ 左右時(shí)，加入 5%的 Gold View染料，混勻，既成瓊脂糖膠液。 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 將膠槽置于水平支持物上，將瓊脂糖膠液倒入膠槽中，使凝膠厚度約為 cm，趕走氣泡后迅速插上梳子，讓膠凝固。 待凝膠完全凝固后（約 20~30 min），小心從一側(cè)取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，讓液面高出膠面 1 mm左右。 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 取待檢測樣本適量，按照 5份上樣液搭配 1份 6 DNA Loading Buffer的比例混勻（注意不要產(chǎn)生氣泡），用微量移液器小心加入樣品槽中。每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止交叉污染。注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 2022年 7月 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 加完樣后立即接通電源?？刂齐妷盒∮?8 V/cm，電流在 100 mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到凝膠 2/3時(shí)，停止電泳。 在紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。保存圖像。 2022年 7月 內(nèi)容回顧 DNA提取 ?CTAB法 ?SDS法 DNA提取 ?堿裂解法（離心柱型） RNA提取 ?異硫氰酸胍 /苯酚法（ TRIzol法） 2022年 7月 下午實(shí)驗(yàn)課（ 14:3018:00） 《 質(zhì)粒 DNA提取及瓊脂糖電泳分析 》 2022年 7月 The End！ Thank You！ Any Questions？
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