核酸提取原理及方法(編輯修改稿)
2025-01-04 10:17 本頁面
【文章內容簡介】 NA提取 —— 堿裂解法 ? 堿裂解法試劑配方 組分 1 組分 2 Ⅰ 液 25 mM TrisHCl （ pH ） 10 mM EDTA（ pH ） Ⅱ 液 M NaOH 1% SDS Ⅲ 液 3 M KAc （ pH ） RNase A 10 μg/ml RNase A 洗脫液 EB 10 mM TrisHCl （ pH ） 1 mM EDTA （ pH ） 2022年 7月 質粒 DNA提取 —— 實驗流程 對數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 過柱 干燥溶解 離心洗滌 質粒 DNA溶液 離心 詳細實驗步驟請參考說明書！ 2022年 7月 質粒 DNA提取 —— 電泳檢測 ?瓊脂糖凝膠電泳檢測 質粒 DNA的三種帶型： DNA分子：質粒雙鏈沒有斷裂；超螺旋結構；泳動速度 最快 ； 質粒 DNA分子：質粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；泳動速度 最慢 ； DNA分子：質粒的兩條鏈均斷裂；泳動速度 居中 。 2022年 7月 質粒 DNA提取常見問題 ? RNA殘留 ? 質粒斷裂 ? 量少 2022年 7月 質粒 DNA提取常見問題分析 ? RNA殘留 ? 忘記加 RNase A？ ? I液中 RNase A失效？ ? 酶量不夠？ 2022年 7月 質粒 DNA提取常見問題分析 ? 質粒斷裂 ? II 液裂解時間過長？ ? 裂解時動作過于劇烈？ 2022年 7月 質粒 DNA提取常見問題分析 ? 量少 ?凝膠是否有問題？ ?菌體量少 ?菌體重懸不徹底 ?裂解不完全 ?菌株老化 ?嚴謹型質粒 2022年 7月 質粒類型 ? 嚴謹型： 這些質粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下進行的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝； ? 松馳型： 這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下進行的，每個細胞中含有 10200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成才會使質?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質粒 pBR322即屬于松弛型質粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。 2022年 7月 一． 核酸簡介 二． 基因組 DNA提取 三． 質粒 DNA提取 四． 真核細胞總 RNA提取 五． 瓊脂糖凝膠電泳 2022年 7月 總 RNA提取 —— 通用方法 ? 異硫氰酸胍 /苯酚法（ TRIzol法） 原理： 核酸在中性條件下，因磷酸基解離而帶負電荷，這一部分由于水化而溶于水。而在酸性條件下，磷酸基的負電荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的處理下， DNA向疏水性的酚層移動，而 RNA由于有 OH的存在有親水性，因此向水層移動。 2022年 7月 TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使 RNA與蛋白質分離，并將 RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣 RNA與仍留在有機相中的蛋白質和 DNA便分離開。水相層主要為 RNA，有機層主要為 DNA和蛋白質。 2022年 7月 總 RNA提取及檢測 —— 實驗準備 臺式高速冷凍離心機、移液器、定時器、 marker筆、酒精噴壺、 電子天平、電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀）、紫外分光光度計、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。 mL EP管（ RNase free）、各規(guī)格 Tip （ RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。 TRIzol 總 RNA提取試劑（ YRBIO) 、氯仿、異丙醇、 75%乙醇 （ RNase free）、 DEPC
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