核酸提取原理及方法(編輯修改稿)
2025-01-04 10:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 NA提取 —— 堿裂解法 ? 堿裂解法試劑配方 組分 1 組分 2 Ⅰ 液 25 mM TrisHCl （ pH ） 10 mM EDTA（ pH ） Ⅱ 液 M NaOH 1% SDS Ⅲ 液 3 M KAc （ pH ） RNase A 10 μg/ml RNase A 洗脫液 EB 10 mM TrisHCl （ pH ） 1 mM EDTA （ pH ） 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取 —— 實(shí)驗(yàn)流程 對(duì)數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 過柱 干燥溶解 離心洗滌 質(zhì)粒 DNA溶液 離心 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)參考說明書！ 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取 —— 電泳檢測(cè) ?瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 質(zhì)粒 DNA的三種帶型： DNA分子：質(zhì)粒雙鏈沒有斷裂；超螺旋結(jié)構(gòu)；泳動(dòng)速度 最快 ； 質(zhì)粒 DNA分子：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；泳動(dòng)速度 最慢 ； DNA分子：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；泳動(dòng)速度 居中 。 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題 ? RNA殘留 ? 質(zhì)粒斷裂 ? 量少 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? RNA殘留 ? 忘記加 RNase A？ ? I液中 RNase A失效？ ? 酶量不夠？ 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? 質(zhì)粒斷裂 ? II 液裂解時(shí)間過長(zhǎng)？ ? 裂解時(shí)動(dòng)作過于劇烈？ 2022年 7月 質(zhì)粒 DNA提取常見問題分析 ? 量少 ?凝膠是否有問題？ ?菌體量少 ?菌體重懸不徹底 ?裂解不完全 ?菌株老化 ?嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 2022年 7月 質(zhì)粒類型 ? 嚴(yán)謹(jǐn)型： 這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下進(jìn)行的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝； ? 松馳型： 這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下進(jìn)行的，每個(gè)細(xì)胞中含有 10200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒 pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。 2022年 7月 一． 核酸簡(jiǎn)介 二． 基因組 DNA提取 三． 質(zhì)粒 DNA提取 四． 真核細(xì)胞總 RNA提取 五． 瓊脂糖凝膠電泳 2022年 7月 總 RNA提取 —— 通用方法 ? 異硫氰酸胍 /苯酚法（ TRIzol法） 原理： 核酸在中性條件下，因磷酸基解離而帶負(fù)電荷，這一部分由于水化而溶于水。而在酸性條件下，磷酸基的負(fù)電荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的處理下， DNA向疏水性的酚層移動(dòng)，而 RNA由于有 OH的存在有親水性，因此向水層移動(dòng)。 2022年 7月 TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使 RNA與蛋白質(zhì)分離，并將 RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣 RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和 DNA便分離開。水相層主要為 RNA，有機(jī)層主要為 DNA和蛋白質(zhì)。 2022年 7月 總 RNA提取及檢測(cè) —— 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、移液器、定時(shí)器、 marker筆、酒精噴壺、 電子天平、電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀）、紫外分光光度計(jì)、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。 mL EP管（ RNase free）、各規(guī)格 Tip （ RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。 TRIzol 總 RNA提取試劑（ YRBIO) 、氯仿、異丙醇、 75%乙醇 （ RNase free）、 DEPC
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