dna和rna提取原理和方法(已修改)
2025-05-27 21:22 本頁(yè)面
【正文】 核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析 主講人：劉召華 唐維（修改） 第一部分： DNA提取方法簡(jiǎn)介 第二部分： DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、 原因分析及其對(duì)策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡(jiǎn)介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見(jiàn) 問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作 。 前言 第一部分： DNA提取方法簡(jiǎn)介 第二部分： DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、 原因分析及其對(duì)策 第三部分： RNA提取方法簡(jiǎn)介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見(jiàn) 問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策 提取方法簡(jiǎn)介DNA提取的幾種方法 ? 基因組 DNA的提取 ? CTAB法 ? SDS法 ? 其它 DNA提取的幾種方法 ? 非基因組 DNA的提取 ? 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? 線粒體、葉綠體 DNA的提取 ? 差速離心結(jié)合 SDS裂解法 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法原理 （植物 DNA提取經(jīng)典方法） ? CTAB（ hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。 ? 具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里 ? 該復(fù)合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。 注： CTAB溶液在低于 15℃ 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于 15℃ 。 ? CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 2%(W/V) %（ V/V）使用前加入 ? TrisHCl （ ） 提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ? EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； ? NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使 DNP（脫氧核糖核蛋白 ）。 CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； ? β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除 基因組 DNA－ CTAB法 褐變 ? CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB PVP40 β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（ V/V）使用前加入 ? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少 DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 基因組 DNA－ CTAB法 PVP（聚乙烯吡咯烷酮） ? PVP 按其平均分子量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常以K值表示，不同的 K值分別代表相應(yīng)的 PVP平均分子量范圍。 K值實(shí)際上是與 PVP水溶液的相對(duì)粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用 K值來(lái)表征 PVP的平均分子量。通常 K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。 ? ? 在研磨過(guò)程中加入 PVP，其中的 CON=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機(jī)會(huì)。 ? 同時(shí)向抽提液中加入還原劑 β巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。 ? CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ CTAB法 ? SDS法原理 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS是一種陰離子去垢劑 ， 在高溫 （ 55～ 65℃ ） 條件下能裂解細(xì)胞 ， 使染色體離析 ， 蛋白變性 ， 釋放出核酸； ? 提高鹽 (KAc或 NH4Ac)濃度并降低溫度 （ 冰浴 ） ， 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 ， 離心后除去沉淀； ? 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提 ， 反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度
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