dna限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制(已修改)
2025-01-17 02:55 本頁面
【正文】 第 四 節(jié) DNA限制酶切反應(yīng)和 限制酶譜繪制 一． DNA的限制酶反應(yīng) 1. 酶單位定義 : 使 1μg某種 DNA在最適反應(yīng)條件下和 1小時(shí)內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反應(yīng)類型 1) 完全酶切 SV40(5243bp) pBR322(4363bp) 2) 部分酶切 3. 酶切反應(yīng)最適條件 1) DNA分子的組成 i. 堿基組成與排列方式 ii. 識別位點(diǎn)兩側(cè)的堿基組成與排列方式 ， 同一 DNA分子中不同識別位點(diǎn)的酶切速度可相差 10倍 （ 如 λ中的 EcoRI位點(diǎn) ） 2) 反應(yīng)條件 i. DNA溶液的純度和濃度 （ 反應(yīng)濃度 ） 依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩? HpaI(C CGG) 1 26 ThaI (CG CG) 0 23 ii. 限制酶的純度和穩(wěn)定性 i) 純度：盡可能保持廠家推薦的反應(yīng)條件 ii) 穩(wěn)定性：保存和反應(yīng) iii. 反應(yīng)緩沖液 ： 常用三種核心緩沖液，即高（ H），中（ M），低（ L）鹽緩沖液，不同溫度下的 pH值 iv. 反應(yīng)溫度 ： 大多數(shù)為 37℃ v. 雙酶切和多酶切反應(yīng) 同時(shí)酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應(yīng)溫度必須相同，即使相同時(shí)，一旦發(fā)生部分酶切反應(yīng)，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者 分別酶切。 i) 第一種酶切 電泳檢查 酚 /氯仿純化 第二種酶切。 可不考慮酶切先后順序，但操作步驟多。 ii) 采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切 電泳檢查 采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但要分先后。 假如兩酶切位點(diǎn)相距很近（如多克隆位點(diǎn)區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時(shí)，其結(jié)果大不相同。 如 SmaIBamH(c), BamHISmaI(p) 二、限制酶圖譜的繪制 1. 完全酶切作圖法 1） 單酶切作圖法 一長度為 5Kb的線狀 DNA分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點(diǎn)的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。 i. 單酶部分酶切 ：部分酶切時(shí)，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個(gè) DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。 ii. 末端標(biāo)記完全酶切 DNA片段 末端標(biāo)記 完全酶切 凝膠電泳 EtBr染 色觀察 放射自顯影 2) 雙酶切作圖法 單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點(diǎn)，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時(shí)則不行 分別作圖時(shí)，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當(dāng)作在一張圖上時(shí)，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見圖 根據(jù)上述的原理和步驟，前述的 5 Kb片段酶 I與酶 II的定位結(jié)果可用兩種方法之一： i) 單酶切 分離 DNA片段 第二種酶切 凝膠電泳 ii)單酶切 第二種酶切 凝膠電泳 *如果要同時(shí)將兩種限制酶定位在一條 DNA上時(shí)，單酶完全酶切作圖就沒必要了。 2. 末端標(biāo)記 部分酶切作圖法 （ SmithBrinstiel法） DNA片段 末端標(biāo)記 酶 1切 分離帶標(biāo)記 DNA片段 酶 2部分酶切 電泳 EtBr染色照相 放射自顯影 結(jié)果 單端標(biāo)記方法 : 人工合成單端標(biāo)記法 限制酶切單端標(biāo)記法 單端標(biāo)記方法 1 人工合成單端標(biāo)記法 單端標(biāo)記方法 2 限制酶切單端標(biāo)記法 3. 末端標(biāo)記雙相作圖法 方法 2仍存在兩個(gè)不足之處：①酶 1的選擇不能靠近 DNA中央；②需先分離 DNA片段，該法可克服上述缺點(diǎn)。 現(xiàn)假設(shè)有一片段長 10 Kb，其中 RE1有三個(gè)切點(diǎn)， RE2有一個(gè)切點(diǎn)，其圖譜可能是 : 4. Bal31順序酶解作圖法 DNA片段 Bal31處理不同時(shí)間取樣終止反應(yīng) 限制酶切 凝膠電泳 染色觀察結(jié)果 5. 切口移位作圖法 (可檢測出 100bp片段 ) 雙鏈 DNA 切口移位 限制酶切 電泳 放射自顯影 6. 大尺度限制酶作圖 1) 條件 i. 電泳方法 脈沖場凝膠電泳 ii. 樣品制備 原位 DNA制備和酶解 iii. 人工染色體構(gòu)建 pYAC載體構(gòu)建 iv. 脊椎動(dòng)物基因組中的 CpG和植物基因組中的 CpXpG序列存在 2) 一般作圖程序 原位 DNA樣品制備 原位 DNA限制酶切 脈沖場凝膠電泳 染色 觀察 3) 大尺度作圖用酶 i. 稀有識別序列內(nèi)切酶 I型內(nèi)含子內(nèi)切酶 (真菌細(xì)胞核和線粒體基因組 ,T4噬菌體 ,衣藻葉綠體和線粒體 )；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌 recA 雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長： 1019 bp，但高等動(dòng)植物基因組中含有這類位點(diǎn)卻極少，因而很少使用 ii. II型限制酶 人基因組有 45,000個(gè) CpG島 ,一個(gè)長度約為 kb富含 GC的DNA片段 ,其中只有 25%的 CpG島未被甲基化 ,這些 CpG島常位于基因的 5’端 ,未被甲基化的 CpG島平均長約 270 kb 可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識別 8或 6 bp序列；富含或只含 GC序列；含有 CpG序列 i) AscIGGCGCGCC和 NotIGCGGCCGC ii) FseIGGCCGGCC和 SrFIGCCCGGGC iii) SfiIGGCCNNNNNGGCC iv) CpoI/CspI/RsrIICGGA(T)CCG v) BssHIGCGCGC,EagICGGCC
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