【文章內容簡介】 當于分子量 1~500kD。 膜分離技術 透析 三、離心 ? 離心是借助于離心機旋轉所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質分離的技術。 ? 在酶的提取和分離純化過程中，細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。 ? 超速離心機的最大轉速達 25000~80000r/min， 最大相對離心力達 500000g， 甚至更高。超離心法只能處理小體積的試樣，主要用于病毒、細胞顆粒等的制備，對分子量較小的酶或蛋白質分離效果一般不佳。 根據(jù)電學解離性質不同進行的純化 ? 吸附色譜法 ? 電泳分離法 ? 聚焦色譜 ? 快速液相色譜 ? 疏水色譜 一、吸附交換（色譜） ? 這也是最常用的一類純化方法。這是利用樣品中待純化分子和雜質分子與吸附劑間吸附能力與解吸性質不同而建立的分離純化方法。這類方法或以靜態(tài)方式進行，或以色譜方式進行。對于后者，混合物隨流動相通過由吸附劑組成的固定相時由于 吸附劑對不同物質的不同吸附力 而使混合物分離。 ? 不管用哪種方式，都包括三個基本環(huán)節(jié)：加樣吸附、洗滌和洗脫。 吸附色譜 ? 根據(jù)吸附機制不同，吸附劑可分為三種類型：物理吸附劑、羥基磷灰石吸附劑和離子交換吸附劑。 ? 、氧化鋁和磷酸鈣 吸附色譜 ? 負吸附：從混雜的酶蛋白溶液中吸去不需要的雜蛋白。 ? 正吸附：吸附所需要的蛋白質 ? 影響吸附、洗脫的的主要因素： ? pH 正吸附在較低的 pH下進行 負吸附可在較高的 pH及離子強度下進行 ? 離子強度 低鹽濃度有利于吸附 ? 蛋白質濃度 1%以減少蛋白質間的相互作用， 利于吸附。 ? 吸附劑與蛋白質比例 蛋白質 /吸附劑 =~10(w/w) 2. 羥基磷灰石吸附 ? 羥基磷灰石柱色譜常用以分離凝膠色譜或離子交換色譜所不能分離的酶蛋白。 3. 離子交換色譜 ? 這是根據(jù)物質的酸堿度、極性和分子大小的差異而予以分離的技術，包括吸附、吸收、穿透、擴散、離子交換、離子親和力等物理化學過程，在實際應用中常根據(jù)使用目的靈活地突出上述作用中的某一個，使之起主導作用。 （一）離子交換劑的選擇 ? ： pH pI時穩(wěn)定，用陰離子交換劑 pHpI時穩(wěn)定，用陽離子交換劑 ? pI偏向極端（ 6或 9），強型 強弱均可時優(yōu)先考慮弱型 ? 對于 10000~100000的分子， Sephadex A50,C50 分子量 400000的分子， Sephadex A25,C25, Sepharose （二）離子交換色譜主要操作過程 ? 選離子交換劑，選定起始 pH →溶脹裝柱 →平衡 →加樣 →洗去未結合物 →洗脫結合物→脫鹽 →再生 (三 )離子交換色譜的基本原理 ? 吸附（交換）：靠蛋白質表面的荷電基團與離子交換劑上密集的電荷叢之間的靜電引力。 ? 洗脫：通過控制 pH、 離子強度，使靜電引力下降。 ? 不同的蛋白質與離子交換劑間的引力減弱不同，從而可達到分離的目的。 （四）離子交換色譜的適用范圍 ? 離子交換色譜既可在大規(guī)模水平也可在小規(guī)模水平上進行，幾乎所以的酶 /蛋白質都可用此法分離、分辨率高。 ? 離子交換色譜前樣品應經(jīng)過預處理，可用透析、凝膠色譜等處理，使與起始緩沖液有相同的 pH和離子強度。 ? 一般酶都要經(jīng)過多步的離交色譜、凝膠色譜等才能達到所要求的目的。 二、電泳分離法 ? 這是根據(jù)各種蛋白質在解離、電學性質上的差異，利用它們在電場中的遷移方向與遷移速度的不同而進行純化的一類方法。 ? 自由界面電泳 ? 區(qū)帶電泳 膜電泳，粉末電泳，膠電泳 ? 等電聚焦電泳 紙電泳 ? （一）凝膠電泳 ? 凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結構的多孔凝膠作為支持體的電泳技術。由于凝膠電泳同時具有電泳和分子篩的雙重作用，故具有很高的分辨率。 ? （二）等電聚焦 ? 在電解槽中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的 pH梯度，當?shù)鞍踪|放進此體系時，不同的蛋白質即移動到或聚集于與其相當?shù)牡入婞c pH位置上，不再移動而達到分離的目的。 ? 優(yōu)點：高分辨率 ? 缺點：不適用于在等電點不溶或發(fā)生變性的蛋白質。 電泳分離法 聚丙烯酰胺凝膠 (PAG) DISC電泳 (Discontinous electrophoresis) ? 在細玻璃管中制成雙層聚丙烯酰胺凝膠，用不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)進行電泳，試樣在開始時即會濃縮成極薄的層狀。 ? 凝膠分為三層，分離膠，成層膠和樣品膠 （三） SDS PAGE SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 原理：蛋白質溶液中加入足夠量的 SDS和巰基乙醇后，含有亞基的蛋白質解離成單個的亞基，在一定條件下， 1g蛋白質 /亞基結合，形成 SDS蛋白質復合物，由于蛋白質結合了大量的 SDS陰離子，抵消了不同蛋白質間固有的電荷差異；同時蛋白質構象發(fā)生變化，呈長橢圓形其短軸都為 ，與蛋白質無關，長軸與蛋白質的分子量 M成正比。 ? 一般電泳中，遷移率 m∝ q/f， q顆粒電荷，f摩擦系數(shù)。 ? SDS電泳中 m僅與蛋白質（亞基）的分子量有關，㏒ M=Cbm。 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳因此可用于蛋白質分子量的測定。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDSPAGE SDSPAGE ? SDSPAGE廣泛用于測定蛋白質的分子量和檢驗樣品純度． SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1. 混合物 2. 鹽析 3. 離子交換 4. 凝膠過濾 5. 親和色譜 10micrograms loaded in each lane 每道加樣 10微克 評介純度 Assess purity Standards | Crude Ext. | Pooled fractions Procedure Fraction vol (ml) Total Prot (mg) Activity (units) Specific activity Units/mg Crude cellular extract 1400 10000 100000 10 Separation method 1 90 400 80000 200 Separation method 2 8 4 60000 15000 Purification Table 三、聚焦色譜 ? 這是根據(jù)蛋白質的等電點差別進行色譜分離的純化方法，兼具等電聚焦電泳的高分辨率和柱色譜的簡便性兩種特點。 ? 原理： ? 當用特定的多緩沖液（ polybuffer,PB） I滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特定多緩沖交換劑（ polybuffer exchanger,PBE） 時，隨著這種緩沖液的擴展，就會在色譜柱中自上而下建立起連續(xù)的 pH梯度，而該色譜柱中的蛋白質也將隨 PB的擴展按各自的 pI聚焦于相應的 pH區(qū)段，并隨擴展過程 pH梯度的逐漸下移而下移，最后分別從色譜柱先后洗出，達到分離純化的目的。 聚焦色譜 ? 這一方法的關鍵是選用適當?shù)亩嗑彌_交換劑和多緩沖液，以便在色譜柱中建立 pH梯度。 ? 聚焦色譜的實驗流程： ? 1)根據(jù)樣品等電點選擇適宜的多緩沖交換劑和多緩沖液； ? 2)調整起始緩沖液 pH至梯度上限，以該緩沖液平衡多緩沖交換劑，裝柱； ? 3)調整多緩沖液 pH至梯度下限，以此緩沖液5~10 ml 流過柱； ? 4)加樣，以調整至梯度下限的多緩沖液擴展、洗脫；分部收集并檢測洗脫液； ? 5)多緩沖交換劑的再生與平衡 聚焦色譜 ? 為了獲得較好的分離效果，有一個選擇適宜的色譜介質與操作條件問題。 ? 1. 選擇適宜的多緩沖交換劑和多緩沖液 ? 構成聚焦色譜系統(tǒng)最基本的因素是多緩沖交換劑和多緩沖液。 Pharmacia公司專門生產(chǎn)了相應的產(chǎn)品。 ? 多緩沖交換劑與多緩沖液組合： 多緩沖交換劑 多緩沖液 應用 pH范圍 PBE 94 polybuffer 96 pH 9~ 6 PBE 94 polybuffer 74 pH 7~ 4 PBE 118 pharmalyte 8~ pH 9 2. 選擇適宜的 pH梯度范圍 ? 如果待分離成分的等電點已知，那么選擇的 pH梯度范圍應能使該成分在 pH梯度的 1/3~1/2處洗出，這樣，分辨率較高，時間也較省。如果樣品的等電點不清楚，最好以 polybuffer 74為最初的選擇對象。因為如果等分離成分的等電點高于此范圍，則樣品將直接流出，很易回收，便于再嘗試其他范圍。反之，選擇的 pH范圍如果高于被分離成分的等電點，則樣品將結合在柱上，需用鹽才能洗下。更主要的原因還在于大多數(shù)蛋白質的等電點都在 pH7~4范圍內。 3. 交換劑的用量 ? 與樣品量、樣品的性質及需要達到的分辨率有關。一般 2030ml 床體積足以對付 1200mg的蛋白質／ pH單位的分離。 ? 4. 樣品 ? 通常情況下不能含有大量的鹽，離子強度應低于；樣品最好先用起始緩沖液