【正文】 式中， s為蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為 I時的溶解度（ g/L）； S0為酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為 0時（即在純?nèi)軇┑娜芙舛龋?g/L）； Ks為鹽析系數(shù)； I為離子強(qiáng)度。 2 常用的中性鹽有硫酸銨，硫酸鈉，硫酸鉀，硫酸鎂，氯化鈉和磷酸鈉，硫酸銨最常用，因為硫酸銨在水里的溶解度大且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。 等電點沉淀法 ? 原理：利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低和不同的電解質(zhì)具有不同的等電點的特性，通過調(diào)節(jié)溶液的 PH，使酶或蛋白質(zhì)沉淀析出，從而使酶和蛋白質(zhì)分離的方法。 ? 加酸堿時，一邊攪拌一邊慢慢加進(jìn)，防止局部過酸過堿一起蛋白質(zhì)變性。 ? 常用的有機(jī)溶劑：乙醇，丙酮，異丙醇，甲醇 ? 影響因素：用量和 PH（最好等電點附近） ? 優(yōu)缺點：比鹽析的沉淀易于離心或過濾；不含無機(jī)鹽，分辨率高，但易引起酶變性失活，所以必須在低溫下操作，沉淀析出后盡快分離，盡量減少有機(jī)溶劑對酶活力的影響。 ? 方法：熱處理，改變 PH或加入某些金屬離子 ? 應(yīng)用此法必須對與分離的酶以及酶液中的雜蛋白的種類含量及其物理和化學(xué)性質(zhì)有較全面的了解。 3超速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速能達(dá)到（ ~12） *104r/min,相對離心力能達(dá)到 5*105甚至更高。 主要用于大小和密度相差較大的顆粒，操作簡單方便，但分離效果較差，沉淀物中含有較多雜質(zhì)，沉淀在離心管的底部受到擠壓。 ㈢ 離心 適當(dāng)?shù)卦黾与x心速度縮短離心時間，減少擴(kuò)少散導(dǎo)致的區(qū) 帶擴(kuò)寬現(xiàn)象。 ? 常用的離心介質(zhì) 氯化銫 硫酸銫 溴化銫 三碘苯的衍生物 過程 1 密度介質(zhì)和樣品結(jié)合 2 離心 注意： 銫鹽對鋁合金轉(zhuǎn)子具有極強(qiáng)的腐蝕作用，防止銫鹽溶液濺到轉(zhuǎn)子上，用完后將轉(zhuǎn)子仔細(xì)清洗和干燥。 FC為離心力； F g為地心引力 。 ? 對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶時間，稱為區(qū)帶形成時間。 ? t表示沉降時間（ s) 。但在超速離心和高速離心時，由于轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會發(fā)熱而引起溫度升高，必須采用冷凍裝置，使溫度維持在一定范圍內(nèi)。 ? 根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同，過濾可分為粗濾，微濾，超濾和反滲透 過濾的分類及其特性 類別 截留顆粒的大小 截留的主要物質(zhì) 過濾介質(zhì) 粗濾 2181。 生物小分子，鹽，離子 反滲透膜 非膜過濾 ? 定義：采用高分子膜以外的材料，如濾紙，濾布，多孔陶瓷，纖維，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱為非膜過濾，包括粗濾和部分微濾 ? 粗濾：借助于過濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于 2181。 微濾 ? 定義：又稱微孔過濾。 ? 一般采用微孔陶瓷，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)，也可用微濾膜。 截留顆粒在 ~2181。用于分離病毒和各種大分子。 3反滲透 反滲透的孔徑小于 20197。用于凝膠電泳后含有的蛋白質(zhì)或核酸的凝膠帶電荷大分子的分離。其中一個相是固定相，另一個相是流動相。特點是可逆的，一定條件下，被吸附物被吸 附到吸附劑表面，另外條件下，被吸附物可離開吸附劑表面，稱為解吸。 從圖可看到，置換洗脫可使每個組分分離，每一個階梯只有一個組分，并可以求出各組分的濃度。 物質(zhì)濃度 洗脫液體積 A A+B A+B+C 吸附劑和洗脫劑的選擇 ? 吸附劑的選擇 ? 吸附劑有無機(jī)吸附劑和有機(jī)吸附劑 ? 由化學(xué)性質(zhì)不活潑的多孔材料制成，比表面積大 ? 常用吸附劑通常用于酶分離純化的有：硅藻土，氧化鋁（活化處理），磷酸鈣，活性炭等 ? 洗脫劑的選擇 ? 注意事項 1洗脫劑不會與吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不會使吸附劑溶解。展開時，樣品各組分在兩相之間不斷地進(jìn)行分配，由于各組分的分配系數(shù)不同，所以移動速率不同，從而達(dá)到分離。 活性基團(tuán)的性質(zhì)不同： 陽離子交換劑和陰離子交換劑 離子交換劑的選擇和處理 母體：苯乙烯樹脂，酚醛樹脂，纖維素，葡聚糖，瓊 脂糖等 引入基團(tuán)： 酸性基團(tuán)：磺酸基（ SO3H),磷酸基（ PO3H2） 堿性基團(tuán)：季胺（ N（ CH3） 3），叔胺（ N（ CH3） 2） 以陽離子交換劑為例： 分配系數(shù)： 平衡常數(shù) K是離子交換劑上活性基團(tuán)與組分離子之間親和力大小的指標(biāo)。 ? 凝膠層析又稱凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等，以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相所含各種組分的相對分子量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。 1 如果組分的分配系數(shù) ka為 0，即 ,說明組分完全不能進(jìn)入凝膠微孔，洗脫時最先流出。 母體一般采用瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺 凝膠。 親和層析方法 親和層析 分子對親和層析 免疫親和層析 共價親和層析 疏水親和層析 金屬離子親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析 分子對親和層析 定義：利用生物分子對之間專一而又可逆的性質(zhì)使生物分子分離純化的方法。 共價親和層析 定義 :生物分子的功能性基團(tuán)與層析劑上的配基形成可逆性的共價鍵的一種分離純化方法。采用氨基烷和溴化氰活化的瓊脂糖進(jìn)行反應(yīng)，形成改性瓊脂糖。用螯合劑將金屬離子（ cu+2,zn+2,co+2等）螯合到母體（如交聯(lián)化的瓊脂糖，葡聚糖 )的表面制成離子親合劑。 優(yōu)點 :可用不同的金屬螯合到母體上，可用更強(qiáng)的螯合劑將金屬離子洗脫，實現(xiàn)母體的再生。 凝集素親和層析 定義：生物分子的功能性基團(tuán)和層析劑上得凝集素形成可逆性結(jié)合的層析方法。 在酶學(xué)研究中，電泳技術(shù)主要用于酶的純度鑒定，酶分子質(zhì)量的測定，酶的等電點的測定以及少量酶的分離純化。 支持體：淀粉 纖維素 硅膠 瓊脂 淀粉最為常用，淀粉板薄層電泳廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，核酸和酶的分離。 獨特之處：具有電泳和分子篩的雙重作用。 3樣品混合液加在電泳的任何部位，經(jīng)過電泳，由于電聚焦的作用，各組分都可以聚焦到各自等電點 PH的位置。 聚焦電泳的操作過程 1pH梯度支持介質(zhì)的制備 2 電泳 3分離組分的檢測 8萃取分離 ? 定義：利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。 2將欲分離組分和預(yù)冷的有機(jī)溶劑結(jié)合 3將有機(jī)相和水相分開 4加熱或抽真空盡快使組分和有機(jī)溶劑分開。 超臨界萃取 ? 超臨界萃取又稱超臨界流體萃取，使利用物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體的溶解度不同而分離的技術(shù)。 9結(jié)晶 1鹽析結(jié)晶 2有機(jī)溶劑結(jié)晶 3透析平衡結(jié)晶 4等電點結(jié)晶 10濃縮與干燥 ? 濃縮除了上述表述的還有蒸發(fā)濃縮 ? 干燥 1真空干燥 2冷凍干燥 3噴霧干燥 4氣流干燥 5吸附干燥