【正文】 酶的提取與分離純化 （制作人：王眾 黃文輝 王晨） 要點(diǎn) １：細(xì)胞破碎 ２：提取 ３：沉淀分離 ４：離心分離 ５：過濾與膜分離 ６：層析分離 ７：電泳分離 ８：萃取分離 ９： 結(jié)晶 10：濃縮與干燥 1 細(xì)胞破碎 ? 細(xì)胞破碎是通過各種過程使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過程。 ? 細(xì)胞破碎的方法 ? 機(jī)械破碎法 ? 物理破碎法 ? 化學(xué)破碎法 ? 酶促破碎法 機(jī)械破碎法 ? 1 搗碎法 ? 定義 利用搗碎機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。 ? 使用范圍 動(dòng)物內(nèi)臟 植物葉芽 細(xì)菌 ? 2 研磨法 ? 利用研缽，石磨，細(xì)菌磨，球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。必要時(shí)加入石英砂等助磨劑。 ? 使用范圍 植物和微生物組織細(xì)胞的破碎 ? 3 勻漿法 ? 利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。 ? 使用范圍 易于分散，顆粒較小，比較柔軟的組織細(xì)胞 也可以對(duì)搗碎法和研磨法產(chǎn)生的顆粒進(jìn)行進(jìn)一步研磨 物理破碎法 ? 定義：通過溫度，壓力，聲波等物理因素的作用是組織細(xì)胞破碎的方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎 ? 1 溫度差破碎法 ? 利用溫度的突然變化 ﹑ 熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎的方法稱為溫度差破碎法 ? 用于脆弱，易于破碎的細(xì)胞的革蘭氏陰性菌，酶提取時(shí) 溫度不能過高，難于用于工業(yè)生產(chǎn) ? 2 壓力差破變化碎法 ? 利用壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎的方法稱為壓力破碎法。常用的有高壓沖擊法，突然降壓法 及滲透壓變化法 ? 滲透壓變化法是滲透壓突然變化引起的細(xì)胞破碎的方法，此法特別適用于膜結(jié)合蛋白酶 ﹑ 細(xì)胞間質(zhì)酶等的提取，但對(duì)革蘭氏陽性菌不適合，主要是細(xì)胞壁由肽聚糖組成，能承受滲透壓的突然變化。 ? 3 超聲波破碎法 ? 利用超聲波發(fā)生器所發(fā)生的聲波或者超聲波的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴（ cavitation)而使細(xì)胞破碎的方法。 ? 簡(jiǎn)便，快捷，效果好，特別適合微生物細(xì)胞的破碎，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行破碎 化學(xué)破碎法 定義：通過各種學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，使細(xì)胞破碎的方法。 常用的化學(xué)試劑：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有機(jī)溶劑 表面活性劑 ：特里頓（ Triton）， 吐溫（ Tween) （非離子型） 原理：有機(jī)溶劑使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，改變細(xì)胞膜的通透性，低溫下進(jìn)行。 表面活性劑與磷脂及至蛋白相互作用，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 表面活性劑有離子型和非離子型兩種。離子型對(duì)細(xì)胞膜的破壞性 效果較好，但會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，故采用非離子型的。 酶促破碎法 定義：通過細(xì)胞自身的酶系或者外加酶制劑 的催化作用，使細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)遭到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。 自溶法： 自身酶系， 取決于溫度，ＰＨ，離子強(qiáng)度。 外加酶： 革蘭氏陽性菌 溶菌酶破壞 β－１ ,４ 糖苷鍵 酵母菌 β－葡聚糖酶 水解 β1， 3葡聚糖 霉菌 幾丁質(zhì)酶 植物細(xì)胞 纖維素酶，半纖維素 酶和果膠酶 ２提取 定義：在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液的過程，也成為酶的提取。 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶劑或溶液 提取對(duì)象 鹽溶液 ~液 用于提取在的低濃度鹽溶液中溶解度大的酶 酸溶液 PH2~6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液 PH8~12的水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 有機(jī)溶劑 可能與水互溶的有機(jī)溶劑 用于那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性集團(tuán)的酶 提取方法 1鹽溶液提?。? 大多數(shù)蛋白酶都溶于水 (P酶），而且在低濃度鹽溶液條件下，酶的溶解度隨著鹽濃度的升高而增大的現(xiàn)象稱為鹽溶。當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的界限后，酶的溶解度隨著濃度的提高而降低的現(xiàn)象稱為鹽析。 核酸類酶（ R酶）的提取，一般在細(xì)胞破碎后，用 取，得到核糖核蛋白提取液，在進(jìn)一步與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離酶ＲＮＡ ２酸溶液的提?。? 有些酶在酸性溶液的溶解度大，且穩(wěn)定性好，宜用酸溶液提取，ＰＨ不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）的硫酸溶液提取 ３ 堿溶液提?。? 適用于在堿溶液溶解度大且穩(wěn)定性好的酶 ，例如Ｌ－天冬氨酸酰胺酶在 ＰＨ１１ ~１２的堿液提取。注意加堿液時(shí)要一邊攪拌一邊攪拌加入，以免局部過堿，造成酶失活。 ４有機(jī)溶劑提取 與脂質(zhì)牢固結(jié)合且含有較多非極性集團(tuán)的酶，可采用與水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有機(jī)溶劑提取，例如琥珀酸脫氫酶，膽堿脂酶，細(xì)胞色素氧化酶采用丁醇提取。 影響提取的主要因素 １溫度 溫度對(duì)酶的提取效果影響明顯，適當(dāng)提高溫度，可以增加酶的溶解度和分子擴(kuò)散速度，但溫度過高會(huì)引起酶的變性失活。采用有機(jī)溶劑時(shí)，溫度控制在０ ~１０ ℃ 低溫條件下。室溫下提取的有酵母醇脫氫酶，細(xì)菌堿性磷酸酶，胃蛋白酶。 ２ＰＨ 溶液的ＰＨ對(duì)酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響，不同的ＰＨ酶會(huì)帶不同的電荷及其帶的電荷量不同，酶在等電點(diǎn)的溶解度最低，故提高溶解度應(yīng)該避開等電點(diǎn)，但不能過高過低。 ３提取液的體積 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。過量的提取液會(huì)使酶濃度降低，對(duì)分離純化不利。所以提取液總量一般為原料體積的３ ~５體積，最好分幾次提取。 在酶的提取過程中，體積小，顆粒的比表面積大，擴(kuò)散面積大，有利于提高擴(kuò)散速度，適當(dāng)?shù)臄嚢韬瓦m當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，可使酶更好的溶解出來。注意為了保護(hù)酶的穩(wěn)定性，可加某些保護(hù)劑，如與酶作用的底物，輔酶，某些抗氧化劑。 ３沉淀分離 定義：沉淀分離就是改變某些條件或者加入某些物質(zhì)， 使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 沉淀分離方法 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法 利用不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同的特性，通過在酶液中 定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，使酶和雜質(zhì)分離 等電點(diǎn)沉淀法 利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最低的特點(diǎn)和不同的物質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)的特 點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)溶液的ＰＨ，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶和雜質(zhì)分離 有機(jī)溶劑沉淀法 利用酶在有機(jī)溶劑具有不同溶劑的特點(diǎn)，通過加入一定量的有機(jī)溶劑，使酶和雜 質(zhì)分離 鹽析沉淀法 ? 定義 :鹽析沉淀法簡(jiǎn)稱鹽析，是利用不同的蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度下溶解度不同的特性，通過在酶液中加入一定濃度的中性鹽，使目標(biāo)酶或雜質(zhì)從酶液中析出，從而達(dá)到使酶與雜質(zhì)分開的方法。 ? 原理：鹽離子會(huì)改變蛋白質(zhì)表面的電荷，同時(shí)改變了水