【正文】 酶的提取與分離純化 （制作人：王眾 黃文輝 王晨） 要點 １：細胞破碎 ２：提取 ３：沉淀分離 ４：離心分離 ５：過濾與膜分離 ６：層析分離 ７：電泳分離 ８：萃取分離 ９： 結(jié)晶 10：濃縮與干燥 1 細胞破碎 ? 細胞破碎是通過各種過程使細胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術過程。 ? 細胞破碎的方法 ? 機械破碎法 ? 物理破碎法 ? 化學破碎法 ? 酶促破碎法 機械破碎法 ? 1 搗碎法 ? 定義 利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。 ? 使用范圍 動物內(nèi)臟 植物葉芽 細菌 ? 2 研磨法 ? 利用研缽，石磨，細菌磨，球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。必要時加入石英砂等助磨劑。 ? 使用范圍 植物和微生物組織細胞的破碎 ? 3 勻漿法 ? 利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。 ? 使用范圍 易于分散，顆粒較小，比較柔軟的組織細胞 也可以對搗碎法和研磨法產(chǎn)生的顆粒進行進一步研磨 物理破碎法 ? 定義：通過溫度，壓力，聲波等物理因素的作用是組織細胞破碎的方法。多用于微生物細胞的破碎 ? 1 溫度差破碎法 ? 利用溫度的突然變化 ﹑ 熱脹冷縮的作用使細胞破碎的方法稱為溫度差破碎法 ? 用于脆弱，易于破碎的細胞的革蘭氏陰性菌，酶提取時 溫度不能過高，難于用于工業(yè)生產(chǎn) ? 2 壓力差破變化碎法 ? 利用壓力的突然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力破碎法。常用的有高壓沖擊法，突然降壓法 及滲透壓變化法 ? 滲透壓變化法是滲透壓突然變化引起的細胞破碎的方法，此法特別適用于膜結(jié)合蛋白酶 ﹑ 細胞間質(zhì)酶等的提取，但對革蘭氏陽性菌不適合，主要是細胞壁由肽聚糖組成，能承受滲透壓的突然變化。 ? 3 超聲波破碎法 ? 利用超聲波發(fā)生器所發(fā)生的聲波或者超聲波的作用，使細胞膜產(chǎn)生空穴（ cavitation)而使細胞破碎的方法。 ? 簡便，快捷，效果好，特別適合微生物細胞的破碎，對數(shù)生長期的細胞進行破碎 化學破碎法 定義：通過各種學試劑對細胞膜的作用，使細胞破碎的方法。 常用的化學試劑：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有機溶劑 表面活性劑 ：特里頓（ Triton）， 吐溫（ Tween) （非離子型） 原理：有機溶劑使細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，改變細胞膜的通透性，低溫下進行。 表面活性劑與磷脂及至蛋白相互作用，破壞細胞結(jié)構(gòu)。 表面活性劑有離子型和非離子型兩種。離子型對細胞膜的破壞性 效果較好，但會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，故采用非離子型的。 酶促破碎法 定義：通過細胞自身的酶系或者外加酶制劑 的催化作用，使細胞的外層結(jié)構(gòu)遭到破壞，而達到細胞破碎的方法。 自溶法： 自身酶系， 取決于溫度，ＰＨ，離子強度。 外加酶： 革蘭氏陽性菌 溶菌酶破壞 β－１ ,４ 糖苷鍵 酵母菌 β－葡聚糖酶 水解 β1， 3葡聚糖 霉菌 幾丁質(zhì)酶 植物細胞 纖維素酶，半纖維素 酶和果膠酶 ２提取 定義：在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤旱倪^程，也成為酶的提取。 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶劑或溶液 提取對象 鹽溶液 ~液 用于提取在的低濃度鹽溶液中溶解度大的酶 酸溶液 PH2~6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液 PH8~12的水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 有機溶劑 可能與水互溶的有機溶劑 用于那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性集團的酶 提取方法 1鹽溶液提?。? 大多數(shù)蛋白酶都溶于水 (P酶），而且在低濃度鹽溶液條件下，酶的溶解度隨著鹽濃度的升高而增大的現(xiàn)象稱為鹽溶。當鹽濃度達到一定的界限后，酶的溶解度隨著濃度的提高而降低的現(xiàn)象稱為鹽析。 核酸類酶（ R酶）的提取，一般在細胞破碎后，用 取，得到核糖核蛋白提取液，在進一步與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離酶ＲＮＡ ２酸溶液的提?。? 有些酶在酸性溶液的溶解度大，且穩(wěn)定性好，宜用酸溶液提取，ＰＨ不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）的硫酸溶液提取 ３ 堿溶液提?。? 適用于在堿溶液溶解度大且穩(wěn)定性好的酶 ，例如Ｌ－天冬氨酸酰胺酶在 ＰＨ１１ ~１２的堿液提取。注意加堿液時要一邊攪拌一邊攪拌加入，以免局部過堿，造成酶失活。 ４有機溶劑提取 與脂質(zhì)牢固結(jié)合且含有較多非極性集團的酶，可采用與水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有機溶劑提取，例如琥珀酸脫氫酶，膽堿脂酶，細胞色素氧化酶采用丁醇提取。 影響提取的主要因素 １溫度 溫度對酶的提取效果影響明顯，適當提高溫度，可以增加酶的溶解度和分子擴散速度，但溫度過高會引起酶的變性失活。采用有機溶劑時，溫度控制在０ ~１０ ℃ 低溫條件下。室溫下提取的有酵母醇脫氫酶，細菌堿性磷酸酶，胃蛋白酶。 ２ＰＨ 溶液的ＰＨ對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響，不同的ＰＨ酶會帶不同的電荷及其帶的電荷量不同，酶在等電點的溶解度最低，故提高溶解度應該避開等電點，但不能過高過低。 ３提取液的體積 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。過量的提取液會使酶濃度降低，對分離純化不利。所以提取液總量一般為原料體積的３ ~５體積，最好分幾次提取。 在酶的提取過程中，體積小，顆粒的比表面積大，擴散面積大，有利于提高擴散速度，適當?shù)臄嚢韬瓦m當?shù)难娱L時間，可使酶更好的溶解出來。注意為了保護酶的穩(wěn)定性，可加某些保護劑，如與酶作用的底物，輔酶，某些抗氧化劑。 ３沉淀分離 定義：沉淀分離就是改變某些條件或者加入某些物質(zhì)， 使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他物質(zhì)分離的技術過程。 沉淀分離方法 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法 利用不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同的特性，通過在酶液中 定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，使酶和雜質(zhì)分離 等電點沉淀法 利用兩性電解質(zhì)在等電點的溶解度最低的特點和不同的物質(zhì)具有不同的等電點的特 點，通過調(diào)節(jié)溶液的ＰＨ，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶和雜質(zhì)分離 有機溶劑沉淀法 利用酶在有機溶劑具有不同溶劑的特點，通過加入一定量的有機溶劑，使酶和雜 質(zhì)分離 鹽析沉淀法 ? 定義 :鹽析沉淀法簡稱鹽析，是利用不同的蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度下溶解度不同的特性，通過在酶液中加入一定濃度的中性鹽，使目標酶或雜質(zhì)從酶液中析出，從而達到使酶與雜質(zhì)分開的方法。 ? 原理：鹽離子會改變蛋白質(zhì)表面的電荷，同時改變了水