【正文】 與單寧復(fù)合可以制成藥片，用于治療咽喉炎 ? 復(fù)合物有的可以直接中使用，有的用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ姑笍膹?fù)合物中析出進(jìn)一步純化。 ? 原理：有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。在實際中，此法經(jīng)常與其他方法一起使用，如等電點經(jīng)常與鹽析沉淀，有機溶劑沉淀，和復(fù)合沉淀一起使用。 ３在硫酸銨鹽析時，常用飽和度表示濃度 定義：溶液中加入飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積之比。 Ks為鹽析系數(shù)，主要取決于鹽的性質(zhì)， Ks與離子價數(shù)成正比，與離子半徑和溶液的界電常數(shù)成反比，與酶或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)液有關(guān)。 沉淀分離方法 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法 利用不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同的特性，通過在酶液中 定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，使酶和雜質(zhì)分離 等電點沉淀法 利用兩性電解質(zhì)在等電點的溶解度最低的特點和不同的物質(zhì)具有不同的等電點的特 點，通過調(diào)節(jié)溶液的ＰＨ，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶和雜質(zhì)分離 有機溶劑沉淀法 利用酶在有機溶劑具有不同溶劑的特點，通過加入一定量的有機溶劑，使酶和雜 質(zhì)分離 鹽析沉淀法 ? 定義 :鹽析沉淀法簡稱鹽析，是利用不同的蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度下溶解度不同的特性，通過在酶液中加入一定濃度的中性鹽，使目標(biāo)酶或雜質(zhì)從酶液中析出，從而達(dá)到使酶與雜質(zhì)分開的方法。所以提取液總量一般為原料體積的３ ~５體積，最好分幾次提取。室溫下提取的有酵母醇脫氫酶，細(xì)菌堿性磷酸酶，胃蛋白酶。注意加堿液時要一邊攪拌一邊攪拌加入，以免局部過堿，造成酶失活。 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶劑或溶液 提取對象 鹽溶液 ~液 用于提取在的低濃度鹽溶液中溶解度大的酶 酸溶液 PH2~6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液 PH8~12的水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 有機溶劑 可能與水互溶的有機溶劑 用于那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性集團的酶 提取方法 1鹽溶液提?。? 大多數(shù)蛋白酶都溶于水 (P酶），而且在低濃度鹽溶液條件下，酶的溶解度隨著鹽濃度的升高而增大的現(xiàn)象稱為鹽溶。離子型對細(xì)胞膜的破壞性 效果較好，但會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，故采用非離子型的。 ? 簡便，快捷，效果好，特別適合微生物細(xì)胞的破碎，對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行破碎 化學(xué)破碎法 定義：通過各種學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，使細(xì)胞破碎的方法。 ? 使用范圍 易于分散，顆粒較小，比較柔軟的組織細(xì)胞 也可以對搗碎法和研磨法產(chǎn)生的顆粒進(jìn)行進(jìn)一步研磨 物理破碎法 ? 定義：通過溫度，壓力，聲波等物理因素的作用是組織細(xì)胞破碎的方法。 ? 細(xì)胞破碎的方法 ? 機械破碎法 ? 物理破碎法 ? 化學(xué)破碎法 ? 酶促破碎法 機械破碎法 ? 1 搗碎法 ? 定義 利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。 ? 使用范圍 動物內(nèi)臟 植物葉芽 細(xì)菌 ? 2 研磨法 ? 利用研缽，石磨，細(xì)菌磨，球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎 ? 1 溫度差破碎法 ? 利用溫度的突然變化 ﹑ 熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎的方法稱為溫度差破碎法 ? 用于脆弱，易于破碎的細(xì)胞的革蘭氏陰性菌，酶提取時 溫度不能過高，難于用于工業(yè)生產(chǎn) ? 2 壓力差破變化碎法 ? 利用壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎的方法稱為壓力破碎法。 常用的化學(xué)試劑：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有機溶劑 表面活性劑 ：特里頓（ Triton）， 吐溫（ Tween) （非離子型） 原理：有機溶劑使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，改變細(xì)胞膜的通透性，低溫下進(jìn)行。 酶促破碎法 定義：通過細(xì)胞自身的酶系或者外加酶制劑 的催化作用，使細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)遭到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的界限后，酶的溶解度隨著濃度的提高而降低的現(xiàn)象稱為鹽析。 ４有機溶劑提取 與脂質(zhì)牢固結(jié)合且含有較多非極性集團的酶，可采用與水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有機溶劑提取，例如琥珀酸脫氫酶，膽堿脂酶，細(xì)胞色素氧化酶采用丁醇提取。 ２ＰＨ 溶液的ＰＨ對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響，不同的ＰＨ酶會帶不同的電荷及其帶的電荷量不同，酶在等電點的溶解度最低，故提高溶解度應(yīng)該避開等電點，但不能過高過低。 在酶的提取過程中，體積小，顆粒的比表面積大，擴散面積大，有利于提高擴散速度，適當(dāng)?shù)臄嚢韬瓦m當(dāng)?shù)难娱L時間，可使酶更好的溶解出來。 ? 原理：鹽離子會改變蛋白質(zhì)表面的電荷，同時改變了水的活度，使分子表面的水化膜發(fā)生改變。 鹽析沉淀法 ? 離子強度 I的計算 I= mi為離子濃度（ mol/L）； 為離子價數(shù) 21 ∑miZi2 iZ 鹽析沉淀法 1 在一定的溫度和 PH條件下（ β為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為 Ks分段鹽析；而在一定鹽濃度和離子強度的條件下（ KsI為常數(shù)），通過改變溫度和 PH，使不同的酶和蛋白質(zhì)分離的方法，稱為 β分段鹽析。相關(guān)數(shù)據(jù)可以查文獻(xiàn)。單獨使用時，主要是從粗酶中除去某些等電點相差較大的蛋白質(zhì)。既增大了溶質(zhì)的靜電引力，又破壞了溶質(zhì)周圍分子的水膜。 選擇性變性沉淀法 ? 定義：選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀，而不影響所需酶的方法。由于轉(zhuǎn)速過高，引起溫度過高引起酶失活，故有的安有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機。 離心方法的選用 1 差速離心 采用不同的離心速度和時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。 密度梯度離心 ㈠ 梯度介質(zhì)的選取 1 有足夠大的溶解度，形成所需的密度梯度 2 不會與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)，也不會引起組分的凝 集，變性和失活 3 常用的密度梯度介質(zhì) 蔗糖 甘油 蔗糖密度梯度系統(tǒng)應(yīng)用最多 ㈡ 密度梯度的制備 一般采用密度梯度混合器進(jìn)行制備。為此兩種密度梯度離心所使用的密度介質(zhì)和密度梯度范圍應(yīng)有所不同。 式中， RCF為相對離心力（ g)。 rnFgFcR C F ????? ? 離心時間 ? 對于低速和高速離心機和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管樣品液的液面完全沉降到離心官底的時間，稱為沉降時間或澄清時間。 沉降時間 ? 沉降時間決定于顆粒的沉降速度和沉降距離。 r1,， r2分別表示旋轉(zhuǎn)軸中心到樣品液液面和離心管底的距離 (cm) ? 上式子做如下變換 k稱為轉(zhuǎn)子因子 )lnln r(1 2 12 w rSt ??Stw rrK ??? )lnln( 2 12溫度和 PH ? 離心溫度一般控制在 4℃ 左右，對于某些耐熱性較好的酶，也可以在室溫下進(jìn)行離心分離。 ? 過濾介質(zhì)不同分為膜過濾和非膜過濾兩大類。~