表達(dá)產(chǎn)物的分離純化-wenkub
2023-05-25 06:06:52 本頁面
【正文】 性質(zhì) ： 對目標(biāo)蛋白不會造成變性； 化學(xué)性能、機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好； 價格低廉。 2） 親和層析： 3） 疏水層析 ： 根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異分離 。 樣品體積大 、 濃度低 ， 應(yīng)在純化前采用沉淀 、 超濾等方法濃縮處理 。 一般是胞內(nèi)可溶性的 ， 首選親和層析純化 。 4） 凝膠過濾層析 ： 根據(jù)蛋白的分子量差異分離 。 分離純化過程的規(guī)模化 蛋白質(zhì)分離純化的實(shí)驗室方法 ， 在產(chǎn)業(yè)化過程未必合適 ， 如： 實(shí)驗室方法在工程上難以實(shí)現(xiàn)，如 超聲 波破碎胞壁。 將蛋白質(zhì)樣品裝入透析袋 ， 置于盛有足量透析液的容器中透析 ， 當(dāng)袋內(nèi) 、 外小分子趨于平衡時 ， 更換透析液 ， 產(chǎn)生新的濃度差 ， 小分子繼續(xù)向外擴(kuò)散 ， 如此多次重復(fù) ， 即可將大分子和小分子分離 ， 分離取決于透析袋的截留分子量 。 實(shí)際上是一種高壓滲透分離方法 ， 通過在膜內(nèi)施加正壓 、 或在膜外施加負(fù)壓 ， 使小分子排出膜外 。 陽離子交換層析 離子交換劑的基本性質(zhì) 1） 亦稱離子交換介質(zhì) ， 為不溶性高分子化合物 ，如樹脂 、 纖維素 、 葡聚糖 、 瓊脂糖等 。 5） 不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵的數(shù)目不同 ， 即結(jié)合力大小不同 ， 選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件 （ 如 改變離子強(qiáng)度 ） ， 可將混合物中的成分逐個洗脫下來 。 pH降低時，電離率逐漸降低，離子 交換能力逐漸減弱。 2）離子交換纖維素 是攜帶功能基團(tuán)的 纖維素衍生物 ， 有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大表面積 ， 大分子可自由通過 ， 對蛋白質(zhì)等 生物大分子 的交換容量比離子交換樹脂大 。 優(yōu)點(diǎn)： 2） 電離基團(tuán)在母體上取代程度高 、 交換容量大 、裝柱方便 、 流速快 。 酸性物質(zhì) ：用陰離子交換劑分離。 層析柱平衡 平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2倍； 平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速； 平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、 pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中 pH值最重要。 樣品洗脫 恒定洗脫 梯度洗脫 線性洗脫 10 20 30 40 50 60 70 80 90 分子濃度 離子強(qiáng)度 pH值 （四）凝膠層析 凝膠層析的基本原理 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 凝膠介質(zhì)的選用原則 凝膠層析的基本操作 凝膠層析的基本原理 凝膠層析是以有一定孔徑范圍的多孔凝膠為固定相，對混合物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱 分子篩 。 注意： 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖凝膠對堿穩(wěn)定 ， 在酸性環(huán)境中糖苷鍵易水解；濕態(tài)的葡聚糖可加熱到 110℃ ， 干的能耐受 120℃ 高溫 。 瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠 ， 適于分離分子量較大的生物大分子 （ 如蛋白質(zhì) 、 DNA） 。 控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠 ，交聯(lián)劑越多 、 孔隙越小 。 2）分級分離 一般選排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠 。 平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時需要的流速； 平衡和洗脫時應(yīng)維持流速恒定； 上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求確定： 進(jìn)樣體積 分級分離 ：樣品溶液的體積要小 (12%)
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