【正文】 .......................................................................................................................... 24 利用無(wú)水乙醇提取多糖 .................................................................................................................................. 25 第四章 雪蓮不同部位成分分析 ............................................................................................................................. 26 實(shí)驗(yàn)儀器與材 料 .............................................................................................................................................. 26 實(shí)驗(yàn)儀器 .................................................................................................................................................. 26 實(shí)驗(yàn)材料及溶劑 ...................................................................................................................................... 26 實(shí)驗(yàn)方法 ........................................................................................................................................................... 26 原料準(zhǔn)備 .................................................................................................................................................. 26 樣品制備方法 .......................................................................................................................................... 26 反相高效液相色譜條件 .......................................................................................................................... 27 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 .............................................................................................................................................. 27 雪蓮各部位 HPLC 色譜圖 ...................................................................................................................... 27 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 .................................................................................................................................................. 29 結(jié)果分析 .................................................................................................................................................. 29 小結(jié) ................................................................................................................................................................... 30 第五章 總結(jié)及展望 ................................................................................................................................................. 31 總結(jié) ................................................................................................................................................................... 31 展望 ................................................................................................................................................................... 31 8北京工商大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 1北京工商大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 概述 新疆雪蓮 (Saussurea involucrata Kar. et Kir .)又稱天山雪蓮、雪蓮花、雪荷花或大苞雪蓮，是維吾爾醫(yī)藥中的常用民族藥，維吾爾名塔裕依力斯， 屬被子植物門、雙子葉植物綱、菊目、菊科、鳳毛菊屬雪蓮亞屬的多年生 草本植物 ，是新疆的珍貴草藥之一。雪蓮還有抗菌、抗輻射、抗寒、耐高山缺氧、強(qiáng)心、解痙鎮(zhèn)靜、平喘等功效。 雪蓮一般生長(zhǎng)在海拔 2400 m以上的高山冰債石、流石灘石隙中，生態(tài)環(huán)境惡劣，自然生長(zhǎng)期 5 一 8 年，最后一年開(kāi)花結(jié) 種且種子萌發(fā)率極低。蛋白質(zhì)和核酸在生命現(xiàn)象中的重要性為世人所知，以基因重組為代表的生物工程己經(jīng)并將大大地造福于人類社會(huì) [2]。第二是在研究方法上較困難。除了很少的例外，基本上蛋白質(zhì)或核酸是由確定位置連接而成的線形聚合物。因此，相對(duì)等量的聚合物能被分離。 自六十年代以來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物功能 [45]。己有不少研究結(jié)果確證，糖類作為信息分子在受精、發(fā)生、發(fā)育分化，神經(jīng)系統(tǒng) 和系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面起著重要作用 。糖藥物的研究與開(kāi)發(fā)必將成為 21世紀(jì)新藥開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要領(lǐng)域。因此不僅可以作為治療疾病的藥物，而且可以作為保健類藥物 [10]。相信經(jīng)過(guò)我國(guó)科研人員的辛勤工作，一定會(huì) 擁有自己獨(dú)立的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，在世界糖藥物研究領(lǐng)域里寫下輝煌的篇章 [12]。一般而言，多糖主鏈上 β(13)糖著鍵是其活性前提。但至今為止，多糖構(gòu)效關(guān)系的研究還沒(méi)有更大的突破。 X 一衍射分析表明，香菇多糖及長(zhǎng) 褶多糖均具 β三股繩狀螺旋型立體結(jié)構(gòu)，在香菇多糖加入尿素或二甲亞礬，其活性就喪失，這二者多糖在水溶液的比旋光度不同在尿素或二甲亞楓中的旋光度，暗示在尿素或二甲亞礬 A 中，多糖立體構(gòu)型改變了，從而引起活性的喪失，這充分證實(shí)立體構(gòu)型對(duì)多糖活性的顯著性影響 [3844]。大量免疫實(shí)驗(yàn)證明多糖不僅能激活 T 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 Mfi, CTL細(xì)胞、 LAK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，還可以激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、自然殺傷細(xì)胞 (NK)等免疫細(xì)胞，清除老化細(xì)胞和異物以及病原體，促進(jìn) IL1, IL2, TNF,INFY 的生成，調(diào)節(jié)機(jī)體抗體和補(bǔ)體的形成及活化促進(jìn)細(xì)胞因子生成，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用[2]，從而提高機(jī)體免疫力達(dá)到抑制或消滅腫瘤細(xì)胞的效果。張慶等人的研究表明，大棗多糖具有明顯的抗補(bǔ)體活性，能顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用 [13]，蘆薈多糖具有抗紫外線引起的免疫抑制作用 [14]。多糖抗腫瘤方式大致可歸納為兩類，以細(xì)胞毒為主的直接抗癌方式和以免疫為主的間接抗癌方式。玉米多糖對(duì)糖尿病小鼠的降糖作用強(qiáng)于正常小鼠，高劑量組降糖幅度大于低劑量組 [15]。甘油三脂含量是此病 的重要指標(biāo)。邵傳森等報(bào)道了中華彌猴桃多糖體外抗輪狀病毒作用。中科院上海有機(jī)所田庚元等于 1996 年報(bào)道，牛膝多糖硫酸酷有抗乙肝病毒的活性 [2123]。其中免疫學(xué)說(shuō)認(rèn)為，免疫功能具有增齡性變化，即隨年齡增大，機(jī)體免疫功能下降或紊亂，結(jié)果胸腺萎縮， T 細(xì)胞損耗，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老，壽命縮短由于多糖類化合物可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，在一定程度上延緩衰老，防治老年病。 抗菌活性 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，許多多糖具有明顯的抗菌作用。沙棘多糖對(duì)大腸桿菌、四疊菌等有一定的抑制作用 [28]。冬蟲夏草多糖治療慢性乙 型肝炎，可在免疫調(diào)節(jié)、保肝和抗病毒。 雪蓮注射液的主要成分是雪蓮黃酮，具有抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛、去風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、提高機(jī)體免疫力、活血化瘀等作用 [27]。 超聲提取植物有效成分 超聲波簡(jiǎn)介 超聲波是指頻率為 2O千赫～ 5O兆赫的電磁波，它是一種機(jī)械波，需 要能量載體 (介質(zhì) )來(lái)進(jìn)行傳播。 超聲波作用機(jī)理 關(guān)于超聲波的作用機(jī)理的論述較多，通過(guò)總結(jié)分析，其作用機(jī)理主要有以下三個(gè)方面： （ 1）空化效應(yīng) 空化效應(yīng)是超聲提取的主要?jiǎng)恿Α? （ 2）機(jī)械效應(yīng) 超聲在傳播過(guò)程中，會(huì)引起介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)交替的壓縮與伸張，構(gòu)成了壓 力的變化，這種壓力的變化將引起機(jī)械效應(yīng)。這些氣泡在經(jīng)歷稀疏相和壓縮相，氣泡生長(zhǎng)、收縮、再生長(zhǎng)、再收縮，經(jīng)多次周期性震蕩，最終以高速度崩裂，然后閉合，該過(guò)程會(huì)產(chǎn)生短暫的局部高溫、高壓。 雪蓮是傳統(tǒng)的藥用植物，具有很高的利用價(jià)值，但是由于生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，以及人類掠奪性的采挖，以造成了這一寶貴物種資源枯竭，本文針對(duì)野生雪蓮 及組培雪蓮 所含的 多糖 成分進(jìn)行超聲 法 提取 及 優(yōu)化的研究，為雪蓮有用成分的提取提供了理論依據(jù)，為合理利用雪蓮資源奠定了基礎(chǔ)。 超聲波法 稱取粉碎好的 組培 23 年雪蓮 樣品 20 g，加入 400 ml 蒸餾水，攪拌均勻后放于提取容器中，超聲 15 min[600 w :(s)]，過(guò)濾分離出上清液 1 和殘?jiān)?；將殘?jiān)俅渭尤?300 ml 蒸餾水，超聲 15 min[600w :(s)]，過(guò)濾分離出上清液 2；將兩次上清液混合 ， 待測(cè)。 （ 2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取葡萄糖 25 mg，加蒸餾水溶解，定容至 250 ml，得到濃度為 mg\ml 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 g）吸光度值/490nm 樣品多糖濃度的測(cè)定 吸取樣品液 ml，按上述操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。 操作步驟 （ 1）分別取牛血清蛋白溶液 ， ， ， , 置于試管中，補(bǔ) mol\l NaCl至 ml； （ 2）加考馬斯亮藍(lán) G250 溶液 ml，立搖勻， 2~5 min 后于 595 nm 處測(cè)吸光度； （ 3）以 ml mol\l NaCl 作空白對(duì)照； （ 4）以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液作橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取雪蓮多糖。 項(xiàng)目 樣品體積（ ml） 20 20 20 20 20 20 20 三氯乙酸量（ ml） 0 1 2 3 4 5 6 吸光度值 \595nm 蛋白質(zhì)濃度（ ug\ml） 蛋白質(zhì)損失率（ %） 吸光度值 \490nm （稀釋 5 倍） 2 多糖 質(zhì)量 （ mg） 多糖損失率（ %） 18北京工商大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 18 Seveage 法除蛋白 按多糖水溶液 1\5~1\4 體積加入氯仿，再加入氯仿體積 1\5 的正丁醇，劇烈振搖 20 min；當(dāng)多糖的水溶液用率方針要成乳化液時(shí)，蛋白質(zhì)變性成膠性蛋白質(zhì)；效率不高，一般要重復(fù) 5 次以上，才能除盡蛋白質(zhì)；為 加速蛋白質(zhì)的變性，最好用 PH4~5 的緩沖液代替。 樹(shù)脂吸附法：脫蛋白效果明顯，對(duì)多糖損失有一定影響，但整個(gè)過(guò)程不會(huì)引人新的雜質(zhì)；另外樹(shù)脂經(jīng)過(guò)處理后能重復(fù)使用。 同時(shí)測(cè)溶液的蛋白損失率和多糖損失率，確定最適脫色方法。 比較個(gè)樣品的顏色變化 ，并在 480 nm 處測(cè)其吸