【正文】 脫。其洗脫曲線雖然也呈階梯型，但只有吸附力最弱的組分得以和其它組分分離，僅用于分析前緣組分分析 分配層析 定義：分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法 分配系數(shù) ：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度的比值。 離子交換劑 是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。上柱時混合液中 鹽離子濃度 不能過高、還要注意混合液的溫度和pH值上柱時要控制合適的流速 洗脫 ：洗脫液應(yīng)當(dāng)含有與離子交換劑的 親和力較大的離子，要通過試驗確定 洗脫流速 。以洗脫體積為橫坐標，以 280nm的光吸收值為縱坐標，繪制洗脫曲線。 ? 在凝膠對組分沒有吸附作用情況下，且 Ve = Vo + VI， 所有組分都應(yīng)該被洗脫出來， Ka最大值為 1 ? 當(dāng) Ka大于 1時，說明此層析不是單純的凝膠層析，還存在吸附層析或離子交換層析 ? 對同一類型的化合物，凝膠層析的洗脫特性與組分的相對分子量呈函數(shù)關(guān)系，洗脫時組分按相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出。凝膠顆粒直徑大小對層析柱內(nèi)溶液的流速有一定影響，應(yīng)選擇大小比較均勻的商品凝膠，使用前需將凝膠于洗脫液中充分溶脹。混合液體積通常為凝膠床體積的 10%左右，濃度可高些，黏度應(yīng)低。然后加入 20%乙醇或 % NaN3在 4－ 8℃ 長期保存 親和層析 ? 親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的 專一而又可逆 的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù) 。即通過某種方法，如溴化氰法、疊氮法、高碘酸氧化法、環(huán)氧化法、甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法等，使母體引入某種活潑基團，才能以共價鍵與配基偶聯(lián) ? 由于親和結(jié)合專一性強， 洗脫條件要求高 。 層析聚焦 －將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離的層析技術(shù) 電泳分離 帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。 電極緩沖液應(yīng)根據(jù)欲分離組分而定。有時也可采用其它流體。 T點和 B點分別表示達到平衡時的上相組成和下相組成，在同一直線上的各點分成的兩相，具有相同的組成，但體積比不同 當(dāng)系線 TMB下移，長度減小，兩相之間的差別逐漸減小，達到臨界點C點時，系線長度為零，達到均相。 在高分子聚合物上引入親和配基，可以進行雙水相親和萃取 雙水相萃取不足： 分離后酶液濃度低 高分子聚合物在分離后需要分離除去 超臨界萃取 超臨界萃取 又稱超臨界流體萃取，是利用 欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同 而達到分離的一種萃取技術(shù) 在相同的壓力和溫度條件下，同一物質(zhì)的液相和氣相的物理特性是截然不同的。 反膠束是超過臨界膠束濃度的表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體。在酶的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用 真空濃縮 －即在一定的真空條件下，使酶液在60℃ 以下進行濃縮 。干燥時間長，酶活力損失大，要控制氣流溫度、速度和流向，同時要經(jīng)常翻動物料，使之干燥均勻 吸附干燥： 密閉容器中用各種干燥劑吸收物料中的水分達到干燥目的，如硅膠、無水氯化鈣、無水硫酸鈣等等 ? 結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在 50%以上，方能進行結(jié)晶。所以酶的結(jié)晶并非達到絕對純化，只是達到相當(dāng)?shù)募兌榷?。 要說明的是，不同的酶對結(jié)晶時的純度要求不同。它不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件 ? 酶在結(jié)晶之前， 酶液必須經(jīng)過純化達到一定的純度 。常用的干燥方法有： 真空干燥 ： 邊抽真空邊加熱， 溫度控制在 60攝氏度以下酶液蒸發(fā)干燥 冷凍干燥： 固態(tài)冰在低溫真空下直接升華為氣體 噴霧干燥： 酶液噴成小霧滴，分散于熱氣流中，水分在幾秒鐘內(nèi)蒸發(fā)，霧滴周圍空氣溫度較低，得到干燥酶制劑。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達到濃縮效果。當(dāng)含有此種反膠束的有機溶劑與蛋白質(zhì)的水溶液接觸后，蛋白質(zhì)及其它親水物質(zhì)能夠進入此水池中，酶不會造成失活。 當(dāng)溫度和壓力超過其超臨界點時，兩相變?yōu)橐幌?，這種狀態(tài)下的流體稱為 超臨界流體 p T G L S SCF 圖 48 超臨界系統(tǒng)相 超臨界流體的顯著特點： ① 其 物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間，適于作萃取溶劑； ② 其具有和液體同樣的溶解能力，具有 很高的萃取速度 ； ③ 隨溫度和壓力變化，其對物質(zhì)的萃取具有選擇性，萃取后易分離 ； ④ 其黏度接近于氣體的黏度， 利于物質(zhì)的擴散 ； 作為萃取劑的超臨界流體必須具備以下條件 ： 1. 具備良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對設(shè)備沒腐蝕性； 2. 臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫或操作溫度附近； 3. 操作溫度應(yīng)低于被萃取溶質(zhì)的分解溫度； 4. 臨界壓力不能太高，節(jié)約壓縮動力； 5. 選擇性要好，容易制得高純度制品； 6. 溶解度要高，可減少溶劑的循環(huán)量； 7. 萃取劑要容易獲得，價格便宜 CO2超臨界萃取的工藝工程由萃取和分離兩個步驟組成，按分離方法不同，分離工藝過程分為： ? 等壓分離：壓力相同，溫度升高，溶質(zhì)在 CO2中溶解度降低而分離析出分離 ? 等溫分離：溫度相同，壓力下降，溶質(zhì)在 CO2中溶解度降低而分離析出 ? 吸附分離：溫度壓力不變，分離罐中的吸附劑吸附溶質(zhì)而分離溶質(zhì) 在超臨界流體萃取中，為提高分離效果，在超臨界流體中添加少量的另一溶劑，稱為 夾帶劑 ，如水、乙醇、丙酮。 T B C T180。 雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖表示，對于兩種聚合物和水相組成的系統(tǒng)，其相圖如圖48所示。 高效液相色譜根據(jù)凝膠介質(zhì)的分離原理不同，又可分為高效凝膠過濾色譜、高效離子交換色譜、高效疏水色譜、高效親和色譜 萃取分離 萃取分離是利用 物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。此外，還受到電場強度、溶液 pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響 。親和介質(zhì)昂貴，處理量不大，制備時只是在純化后期使用 親和層析的四個要素 常用的親和介質(zhì)及專一性配體 根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性 ,親和層析可以分為： 共價親和層析 疏水層析 (要區(qū)別疏水層析與反相層析 ) ★ 金屬離子親和層析 （實驗方法見蛋白質(zhì)工程 p218） 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析 金屬離子親和層析 金屬離子親和層析是利用蛋白類酶和其它蛋白表面的組氨酸的咪唑基團、半胱氨酸的巰基基團、色氨酸的吲哚基團可與金屬離子發(fā)生可逆性親和結(jié)合的特性，用螯合在母體上的金屬離子對混合液中的目標蛋白進行純化。故此 ,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用 ? 親和層析技