【正文】 的離心力相當于地球引力的倍數(shù) 。一般情況下，低速離心時常以 rpm來表示，超速離心則以 g表示 。計算顆粒的相對離心力時，應注意離心管與旋轉中心的 距離 R。由于轉子的形狀及設計差異，離心管的口部和底部到旋轉軸中心距離差異很大。 如：離心管口 R＝ ，管底 R＝ ， rpm＝ 12022 離心機的分類 ? 目前在生物醫(yī)學領域內常用的離心機種類很多，按其 離心轉子能達到最高轉速 分： ? 低速離心機 (在 6,000 rpm以下 ) ? 高速離心機 (在 25,000 rpm以下 ) ? 超速離心機 (在 30,000 rpm以上 ) 離心分離技術的種類 ? 差速離心法是指通過不斷 增加相對離心力 ，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時間下分批離心方法。 差速離心法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒 。 主要用于分離細胞器和病毒。 ?① 差速離心法 (differential centrifugation) ② 密度梯度離心法 ? 亦稱 平衡密度梯度離心法 。密度梯度離心法包括 速度區(qū)帶 和 等密度離心 二種方法。后者又可分為預制梯度等密度及自形成梯度等密度兩種方法。 速度區(qū)帶離心法 ? 在 離心前離心管內預先裝入密度梯度介質 (如蔗糖、甘油、 KBr、 CsCl等 )，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層， 按不同沉降速度向管底沉降 ，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后 形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶 。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。 蔗糖密度梯度離心 等密度離心法 ? 某些密度梯度介質經過離心后會自身形成梯度，如細胞分離液 Percoll。待分離樣品可和梯度介質先均勻混合，梯度介質由于 離心力的作用 逐漸形成管 底部濃 而 管頂稀 的密度梯度，與此同時原來分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。當管底介質的密度大于顆粒的密度時，顆粒上??；當管頂介質的密度小于顆粒的密度時，則顆粒沉降； 最后顆粒進入到一個它本身的密度位置，顆粒不再移動，形成穩(wěn)定的區(qū)帶。 CsCl密度梯度離心 超速離心 ? 超速離心法 (ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質，也可以用作測定蛋白質的分子量。 ? 超速： 50000120220rpm 蛋白質純度的鑒定 各種細分級的方法都可以用于純度鑒定 常用各種電泳法 ，比較權威的有：等速電泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳。 沉降分析和擴散分析 測定 沉降系數(shù)和擴散系數(shù) 。 溶解度恒定法 加入樣品量為橫坐標，樣品溶解量為縱坐標，作 圖。如只有一個拐點則說明樣品純。 蛋白質分子量的測定 最小分子量測定法： 如 Mb含 Fe為 %，則 M=。這就是最小分子量。其實，真實分子量是最小分子量的 n倍， n指 Fe的數(shù)目， Mb的 n=1，所以M=16700； 而 Hb用其他方法測得分子量為 68000，則說 Hb含 4個Fe原子。 滲透壓法 超離心法 凝膠過濾法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質含量的測定 凱氏定氮法 雙縮脲反應 Folin酚試劑反應 紫外吸收法 考馬斯亮藍法 凱氏定氮法 ? 是一種檢測物質中 “含氮總量” 的方法。當天然含氮有機物與 濃硫酸 共熱，分解出 碳、氫、氮形成二氧化碳、水及氨 ，產生的氨能夠與 硫酸 結合，生成硫酸銨，此過程稱為 “消化” 。 ? 這個反應進行的很慢，可加入 硫酸鉀 或 硫酸鈉 提高消化液的沸點，并加入 硫酸銅為催化劑 。 ? 消化后，在凱氏定氮儀中加入 強堿 堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨 。用 水蒸汽蒸餾法 ，將氨蒸入過量標準無機酸 （硼酸） 溶液中，然后用 標準堿溶液進行滴定 ，準確測定氨量，從而折算出含氮量。 雙縮脲反應 ? 原理： 在堿性溶液中，蛋白質因含有兩個以上的肽鍵， 可 與 Cu2+形成 紫紅色絡合物 ， 其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比 ，因此可利用 比色測定 蛋白質含量。在一定條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于 540560nm下 比色，通過標準蛋白質的標準曲線求出未知的蛋白質濃度， 標準蛋白溶液可以用結晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。 Folin酚反應 ? Folin酚試劑法包括 兩步反應 ： 第一步是在堿性條件下，蛋白質 中的 肽鍵與銅 作用生成 蛋白質 銅絡合物 ；第二步是此絡合物將 磷鉬酸 磷鎢酸試劑（ Folin 試劑）還原，產生深藍色 （磷鉬藍和磷鎢藍混合物）， 顏色深淺與蛋白質含量成正比，比色法確定蛋白質含量。同樣需做標準曲線。 特 點 ? 此法操作 簡便，靈敏度比雙縮脲法高 100 倍 ，定量范圍為 5～ 100μg蛋白質。 Folin 試劑顯色反應由 酪氨酸 、 色氨酸 和 半胱氨酸 引起，因此樣品中若含有 酚類、檸檬酸 和 巰基化合物 均有干擾作用。此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同 蛋白質的紫外吸收 ? 蛋白質分子中， 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 殘基的苯環(huán)含有 共軛雙鍵 ，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在 280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成 正比 。利用一定波長下， 蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系 ，可以進行蛋白質含量的測定。 考馬斯亮藍法 (Bradford)法 ? 考馬斯亮蘭法是 1976年由 Bradford建立 的，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的?？捡R斯亮蘭 G250染料，在 酸性溶液 中與蛋白質結合，使染料最大吸收峰的位置由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由 棕黑色變?yōu)樘m色 。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的 堿性氨基酸 （特別是精氨酸）和 芳香族氨基酸殘基 相結合。 在 595nm下測定的吸光度值 A595， 與蛋白質濃度成正比 。 Bradford法的優(yōu)點 ? 這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。 ? （ 1）靈敏度高 ? （ 2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。 ? （ 3）干擾物質少。 缺 點 ? （ 1）由于各種蛋白質中的 精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ，因此 Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。 ? （ 2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有： 去污劑、 Triton X100、十二烷基硫酸鈉（ SDS）和 N的 NaOH。 ? （ 3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用 Beer定律進行計算，而 只能用標準曲線 來測定未知蛋白質的濃度。