【正文】 和 pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為 β 分段鹽析 公式 logS = logS0KsI=β KsI 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。 在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以 飽和度 表示（指溶液中加入的飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積的比值） 解讀蛋白質(zhì)工程 p204頁(yè)表 7－ 3 有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。 常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等 離心分離 離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。 高速離心機(jī) 的最大轉(zhuǎn)速為（ 1～ ） 104 r/min ，相對(duì)離心力達(dá)到 1 104～ 1 105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。必須預(yù)先配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)離心前將樣品小心地鋪放在預(yù)先制備好的密度梯度溶液的表面。 ? 每一 種 的沉降 系數(shù)與 其分子密度或分子量成正比。 過(guò)濾 非膜過(guò)濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì) 膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì) 過(guò)濾的分類及其特性 (根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) 類別 截留顆粒大小 截留的主要物質(zhì) 過(guò)濾介質(zhì) 粗濾 2μ m 酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等 濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等 微濾 ～ 2μ m 細(xì)菌、灰塵等 微濾膜、微孔陶瓷 超濾 20197。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。 膜技術(shù) 截留物尺寸 nm （分子量） 推動(dòng)力 分離機(jī)理 微濾MF 20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分 超濾UF 1～ 20 (10,00040,000) 壓力差100kPa 篩分 納濾NF 1 (100～ 1000) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、表面電位 反滲透RO (100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散 四種常用膜分離技術(shù)的基本特征 四種常用膜分離過(guò)程的截留特性 層析分離 層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法 。 ? 在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程 。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù) 在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為 固定相 ，這種溶劑在層析過(guò)程中始終固定在多孔支持物上。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。洗脫過(guò)程中，組分離子按照與交換劑親和力由大到小的順序先后洗出。根據(jù)洗脫峰的位置，確定不同大小的蛋白質(zhì)所在試管，進(jìn)一步用電泳手段鑒定目標(biāo)蛋白 交換劑再生： 酸－堿－酸處理 堿－酸－堿處理 凝膠層析 凝膠層析又稱為 凝膠過(guò)濾 ， 分子排阻層析 ， 分子篩層析等。 Ve=K1K2 lgM 在實(shí)際應(yīng)用中，常以相對(duì)洗脫體積 Kav對(duì) lgM作曲線 ， 稱為 選擇曲線 相對(duì)洗脫體積 是指組分洗脫體積與層析柱內(nèi)凝膠床總體積之比值 Kav＝ Ve/Vt lgM Kav 0 選擇曲線的斜率說(shuō)明凝膠的特性。溶脹通常采用熱水溶脹（ 2－ 3小時(shí)），這樣也達(dá)到消毒和排出凝膠內(nèi)氣泡的目的 溶脹后凝膠用傾瀉法除去小顆粒，經(jīng)減壓排氣即可裝柱 凝膠層析操作過(guò)程 凝膠層析的操作一般包括裝柱、上柱、洗脫等過(guò)程 裝柱 ：柱內(nèi)先充滿洗脫劑，然后一邊攪拌一邊緩慢而連續(xù)地加入濃稠的凝膠懸浮液，讓其自然沉降，分布均勻無(wú)氣泡和裂縫，直至所需高度。 洗脫 ： 洗脫液應(yīng)與干燥凝膠溶脹時(shí)及裝柱平衡時(shí)使用的一致， 體積一般為凝膠床體積的 120%，洗脫流出液分步收集。 ? 酶與底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶與輔助因子、抗原與抗體、酶 RNA與互補(bǔ)的 RNA分子或片段、RNA與互補(bǔ)的 DNA分子或片段等之間 ，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。在親和層析過(guò)程中，應(yīng)控制好 溫度 （ 0－ 10℃ ）、 pH等條件，以免酶變性失活，親和層析劑免遭破壞。 顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其 本身所帶的凈電荷量 ，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。 一種為陰離子電泳系統(tǒng)，緩沖液 pH為 8－ 9，上槽接負(fù)極，下槽接正極，用溴酚藍(lán)為指示劑，適用于一般蛋白質(zhì)和核酸的分離； 一種為陽(yáng)離子電泳系統(tǒng)，緩沖液 pH為 4左右，上槽接正極，下槽接負(fù)極，用亞甲基綠為指示劑，適用于堿性蛋白質(zhì)的電泳分離 電泳的實(shí)驗(yàn)方法主要要求看 SDS－ PAGE和雙向電泳（詳見(jiàn) 《 蛋白質(zhì)工程 》 p220223） 凝膠層析詳見(jiàn) 《 蛋白質(zhì)工程 》 p213 金屬離子親和層析見(jiàn) 《 蛋白質(zhì)工程 》 p218 高效液相色譜（ HPLC） 高效液相色譜，將常規(guī)層析介質(zhì)制備成特殊的高效液相色譜柱，它使用的基質(zhì)珠更小，孔徑更均一，基質(zhì)填充比常規(guī)層析柱更致密，因此可以耐受更大的壓力，采用更快的洗脫速度，具有更高的分辨率和重復(fù)性。 按照兩相的組成不同，萃取可以分為： 有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取 有機(jī)溶劑萃取 在酶的萃取過(guò)程中，有機(jī)溶劑要預(yù)冷至 0－ 10℃ ，萃取過(guò)程在 0－ 10℃ 低溫條件下進(jìn)行，并盡量縮短酶與有機(jī)溶劑接觸時(shí)間 雙水相萃取 雙水相系統(tǒng)一般是指將兩種親水性的聚合物都加在水溶液中，當(dāng)超過(guò)某一濃度時(shí)，產(chǎn)生兩相，兩種聚合物分別溶于互不相溶的兩相中（每種聚合物在上下相中的分配比率不同） 成相是由于聚合物分子的空間阻礙作用，無(wú)法相互滲透，不能形成均一相，從而具有相分離的傾向。 聚合物 P% B180。當(dāng)溫度和壓力達(dá)到某一特定的數(shù)值時(shí)，氣體和液體的物理特性就會(huì)趨于相同，這個(gè)數(shù)值稱為 超臨界點(diǎn) 。 反膠束中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外，與非極性有機(jī)溶劑接觸，而極性基團(tuán)排列在內(nèi)，形成一個(gè)極性核，極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，形成水池。 離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。 在固體酶制劑的生產(chǎn)過(guò)程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，便于保存、運(yùn)輸和使用，一般都必須進(jìn)行干燥。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段?？偟内厔?shì)是酶的純度越高，越容易進(jìn)行結(jié)晶。 鹽析結(jié)晶 有機(jī)溶劑結(jié)晶 透析平衡結(jié)晶 等電點(diǎn)結(jié)晶 溫度差結(jié)晶