蛋白類酶的分離純化(已修改)
2025-06-07 18:23 本頁面
【正文】 第四章 酶的分離純化 酶分離純化的原因（ 3條） 酶分離純化鑒定的依據(jù)－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（ 9條） 內(nèi) 容 酶的提取與分離純化技術(shù)路線 細胞破碎 酶的提取 酶的分離方法 酶的組合分離純化策略 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶 細胞結(jié)構(gòu)與酶分布 酶的提取、分離純化技術(shù)路線 細胞破碎 酶提取 酶分離純化 酶濃縮 酶貯存 動物、植物或微生物細胞 發(fā)酵液 離心，過濾、沉淀、層析分離、電泳、萃取、結(jié)晶等分離方法 酶 的純化過程，約可分為三 個階段 ： (1) 粗 蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 → 均 質(zhì)打破細胞 → 抽出全蛋白，多使用 鹽 析 沉淀 法 ；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。 (2) 部分純化 (partially purified): 初步的純化，使用各鐘 柱 層 析法 。 (3) 均 質(zhì)酶 (homogeneous): 目標(biāo)酶的 進 一步精制純化，可用制備 式 電泳 或 HPLC。 酶分離純化不同階段 細胞破碎 許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。 1）機械破碎 2）物理破碎 3）化學(xué)破碎 4）酶解破碎 JY92II D超聲波 細胞粉碎機 細胞破碎珠 高壓細胞破碎機 DY89I型 電動玻璃勻漿機 機械破碎 搗碎法 研磨法 勻漿法 物理破碎 溫度差破碎法 壓力差破碎法 超聲波破碎法 化學(xué)破碎 有機溶劑： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑： Triton、 Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制劑法 通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎 。 通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎 。 通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎 通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用 ，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎 細胞破碎方法及其原理 ? 酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。 ? 酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。 ? 酶都能溶解于水， 通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取 ，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。 酶的提取 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好 溫度 、 pH值等提取條件 。 為了使蛋白質(zhì)充分溶解并保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性，蛋白質(zhì)提取緩沖液常包含的成分 ? 控制溶液 pH值的緩沖對； ? 控制溶液離子強度的無機鹽； ? 控制溶液氧化還原狀態(tài)的還原劑； ? 蛋白酶抑制劑 ? 離子螯合劑 ? 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白 ? 去污劑 ? 水和防腐劑 ? 甘油 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶劑或溶液 提取對象 鹽溶液提取 ～ 的鹽溶液 用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶 酸溶液提取 PH2～ 6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液提取 PH8～ 12的水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 有機溶劑提取 可與水混溶的有機溶劑 用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶 大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為 鹽溶現(xiàn)象 。 酶的分離方法 沉淀分離 離心分離 過濾與膜分離 層析分離 電泳分離 萃取分離 沉淀分離 沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的 溶解度降低 ，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法 利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離 等電點沉淀法 利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的 pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 有機溶劑沉淀法 利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 復(fù)合沉淀法 在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離 選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離 在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為 鹽析 現(xiàn)象。鹽析的主要原理在于高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)爭奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，同時由于反離子作用，也影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷 在一定的溫度和 pH值條件下（ β 為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為 Ks分段鹽析 ； 而在一定的鹽和離子強度的條件下（ KsI為常數(shù)），通過改變溫度和 pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為 β 分段鹽析 公式 logS = logS0KsI=β KsI 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。 在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以 飽和度 表示（指溶液中加入的飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積的比值） 解讀蛋白質(zhì)工程 p204頁表 7－ 3 有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃ 時水的介電常數(shù)為 80，而 82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為 40。 溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出 。 常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等
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