【正文】 平衡離子為陰離子，層析介質(zhì)的帶電基團(tuán)帶有正電 離子交換劑的選擇 應(yīng)根據(jù)欲分離組分的特性和要求，過強(qiáng)的吸附以及極端的洗脫條件都可能造成活性分子的變性失活；另外溶液的 pH直接決定離子交換劑活性基團(tuán)及組分離子的解離程度，從而影響了離子交換劑的交換容量和交換的選擇性 選擇離子交換劑時(shí)考慮因素： 1）離子交換劑和組分離子的物理化學(xué)性質(zhì)； 2）組分離子所帶電荷種類； 3）溶液中組分離子的濃度高低； 4）組分離子的質(zhì)量大??； 5）組分離子與離子交換劑的親和力大小 離子交換劑的處理 1）溶脹、洗滌至澄清； 2) 4V 2 mol/L HCl進(jìn)行酸處理，洗滌； 3) 4V 2 mol/L NaOH進(jìn)行堿處理，洗滌； 4）裝柱 5）用適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行轉(zhuǎn)型處理，使離子交換劑上所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)樗桦x子 例如，陽離子交換劑（如）用 NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?Na+型，用 HCl處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?H+型； 陰離子交換劑用 NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?OH型，用 HCl處理轉(zhuǎn)變?yōu)?Cl型 離子交換劑有離子交換樹脂、纖維素、凝膠，某些大孔徑的離子交換樹脂、纖維素、凝膠可用于酶的分離純化。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù) 凝膠層析的基本原理 凝膠層析柱中裝有 多孔凝膠 ，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。裝好后洗脫液浸沒凝膠表面。故此 ,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用 ? 親和層析技術(shù)的特點(diǎn)是 選擇性很高 ， 可減少提純步驟 ? 在親和層析中 ,作為固定相的一方稱為 配基(Ligand)， 配基必須偶聯(lián)于不溶性母體 (Matrix)上，母體又稱為載體或擔(dān)體。此外，還受到電場強(qiáng)度、溶液 pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響 。 雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖表示，對于兩種聚合物和水相組成的系統(tǒng)，其相圖如圖48所示。 當(dāng)溫度和壓力超過其超臨界點(diǎn)時(shí)，兩相變?yōu)橐幌啵@種狀態(tài)下的流體稱為 超臨界流體 p T G L S SCF 圖 48 超臨界系統(tǒng)相 超臨界流體的顯著特點(diǎn)： ① 其 物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間，適于作萃取溶劑； ② 其具有和液體同樣的溶解能力，具有 很高的萃取速度 ； ③ 隨溫度和壓力變化，其對物質(zhì)的萃取具有選擇性，萃取后易分離 ； ④ 其黏度接近于氣體的黏度， 利于物質(zhì)的擴(kuò)散 ； 作為萃取劑的超臨界流體必須具備以下條件 ： 1. 具備良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對設(shè)備沒腐蝕性； 2. 臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫或操作溫度附近； 3. 操作溫度應(yīng)低于被萃取溶質(zhì)的分解溫度； 4. 臨界壓力不能太高，節(jié)約壓縮動(dòng)力； 5. 選擇性要好，容易制得高純度制品； 6. 溶解度要高，可減少溶劑的循環(huán)量； 7. 萃取劑要容易獲得，價(jià)格便宜 CO2超臨界萃取的工藝工程由萃取和分離兩個(gè)步驟組成，按分離方法不同，分離工藝過程分為： ? 等壓分離：壓力相同，溫度升高，溶質(zhì)在 CO2中溶解度降低而分離析出分離 ? 等溫分離：溫度相同，壓力下降，溶質(zhì)在 CO2中溶解度降低而分離析出 ? 吸附分離：溫度壓力不變，分離罐中的吸附劑吸附溶質(zhì)而分離溶質(zhì) 在超臨界流體萃取中，為提高分離效果，在超臨界流體中添加少量的另一溶劑，稱為 夾帶劑 ，如水、乙醇、丙酮。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達(dá)到濃縮效果。它不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件 ? 酶在結(jié)晶之前， 酶液必須經(jīng)過純化達(dá)到一定的純度 。所以酶的結(jié)晶并非達(dá)到絕對純化，只是達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌榷?。干燥時(shí)間長，酶活力損失大，要控制氣流溫度、速度和流向，同時(shí)要經(jīng)常翻動(dòng)物料，使之干燥均勻 吸附干燥： 密閉容器中用各種干燥劑吸收物料中的水分達(dá)到干燥目的，如硅膠、無水氯化鈣、無水硫酸鈣等等 ? 結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。在酶的分離純化過程中是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。 在高分子聚合物上引入親和配基，可以進(jìn)行雙水相親和萃取 雙水相萃取不足： 分離后酶液濃度低 高分子聚合物在分離后需要分離除去 超臨界萃取 超臨界萃取 又稱超臨界流體萃取，是利用 欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同 而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù) 在相同的壓力和溫度條件下，同一物質(zhì)的液相和氣相的物理特性是截然不同的。有時(shí)也可采用其它流體。 層析聚焦 －將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的層析技術(shù) 電泳分離 帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳。然后加入 20%乙醇或 % NaN3在 4－ 8℃ 長期保存 親和層析 ? 親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的 專一而又可逆 的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù) 。凝膠顆粒直徑大小對層析柱內(nèi)溶液的流速有一定影響，應(yīng)選擇大小比較均勻的商品凝膠，使用前需將凝膠于洗脫液中充分溶脹。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以 280nm的光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。 離子交換劑 是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。 ? 層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。膜分離所使用的薄膜主要是由 丙烯腈 、 醋酸纖維素 、 賽璐玢 以及 尼龍 等高分子聚合物制成的高分子膜。 ? 配制中， 將稀溶液置于貯液室 B，濃溶液置于混合室 A, 如圖 42(郭勇酶工程 p96） 流出的梯度液經(jīng)過導(dǎo)管小心收集于離心管 ， 如果濃溶液置于貯液室 B ，稀溶液置于 A室，梯度液的導(dǎo)液管必須直插到離心管的管底 ，讓后來流入的濃度高的混合液將先流入的濃度較低的混合液頂浮起來形成由管口到管底逐步升高的密度梯度 超速離心機(jī)按照其用途可以分為制備用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)和分析 制備兩用超速離心機(jī) 3種 ? 蛋白質(zhì) 分子在 離心 時(shí)，其 分子量、分子密度 、組成、 形 狀 等，均 會(huì)影響 其沉降速率， 沉降 系數(shù) 即用 來描述 此沉降 性質(zhì) ； 其 單位為 S (Svedberg unit)。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 酶的提取 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理