酶工程11酶的定向進(jìn)化-資料下載頁(yè)
2025-05-26 22:00本頁(yè)面
【正文】 片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長(zhǎng)基因片段，重組的程度可以通過(guò)調(diào)整時(shí)間和溫度來(lái)控制。此方法省去了將 DNA酶切成片段這一步，因而簡(jiǎn)化了 DNA重排方法。 交叉延伸程序 短 暫 的 聚 合 / 變 性 反 應(yīng)重 復(fù) 上 述 過(guò) 程重 復(fù) 上 述 過(guò) 程相 關(guān) 的 D N A 家 族特 定 的 引 物 延 伸小 片 段 D N A 合 成P C R 合 成 的 D N A 片 段隨 機(jī) 改 變 模 板 并 進(jìn) 一 步 延 伸當(dāng) P C R 片 段 大 小 接 近全 長(zhǎng) 基 因 時(shí) ， 分 離全 長(zhǎng) 基 因 并 用 基 外引 物 擴(kuò) 增 全 長(zhǎng) 基 因圖 2 S t E P 重 組 基 本 程 序過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng) (random chimeragenesis on transient templates， RACHITT) 過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)技術(shù)是與 DNA shuffling概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重組技術(shù)．它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng)，而是將隨機(jī)切割的基因片段雜交到一個(gè)臨時(shí) DNA模板上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接 。 其中的懸垂切割步驟使短片段 (比 DNase消化片段還短 )得以重組，明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯(cuò)誤傾向 PCR還可引入額外點(diǎn)突變 。 RACHITT RACHITT Coco等報(bào)道此法改造二苯并噻吩單加氧酶，產(chǎn)生的嵌合文庫(kù)平均每個(gè)基因含 14個(gè)交叉，重組水平比 DNA shuffling類(lèi)方法 (1～ 4個(gè)交叉 )高出幾倍；并且可在短至 5 bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉 。 這種高頻率、高密度的交叉水平是 DNAshuffling所難以達(dá)到的 。 分子定向進(jìn)化技術(shù)經(jīng)典實(shí)例 —— 頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排 Moxalactam,羥羧氧酰胺頭孢菌素 頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排 ? 首先從四種不同的細(xì)菌中分別獲得長(zhǎng)度為 酶基因。它們的 DNA同源性很低，從 58%到 82%不等。然后每個(gè)基因分別重排，從各自的文庫(kù)中選出 50000個(gè)克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板。從平板上篩選得到的最好的突變子，它對(duì)羥羧氧酰胺頭孢菌素的抗性相對(duì)于親本來(lái)說(shuō)大約增加了 8倍。 ? 作為比較，對(duì)四個(gè)基因進(jìn)行家族基因重排來(lái)構(gòu)造頭孢菌素酶基因的重組文庫(kù)。同樣選出 50000個(gè)克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板，從中篩選出的最好的克隆子，與抗性較強(qiáng)的親本相比，其抗性增加了 270倍（從 200μg/ml ）；與抗性較弱的親本相比，其抗性增加了 540倍（從 ）。由此可以看出，家族基因重排的效果要比單基因重排好得多。 ? 對(duì)家族基因重排中得到的最好克隆子進(jìn)行進(jìn)一步研究表明它含有來(lái)源于 4個(gè)不同親本中 3個(gè)親本的 8個(gè)片段， 7個(gè)交叉的地方都發(fā)生在序列同源的區(qū)域，并且這個(gè)最好的克隆子含有高達(dá) 33個(gè)的點(diǎn)突變。
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