酶工程11酶的定向進化-資料下載頁
2025-05-26 22:00本頁面
【正文】 片段可以隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。此方法省去了將 DNA酶切成片段這一步，因而簡化了 DNA重排方法。 交叉延伸程序 短 暫 的 聚 合 / 變 性 反 應(yīng)重 復(fù) 上 述 過 程重 復(fù) 上 述 過 程相 關(guān) 的 D N A 家 族特 定 的 引 物 延 伸小 片 段 D N A 合 成P C R 合 成 的 D N A 片 段隨 機 改 變 模 板 并 進 一 步 延 伸當(dāng) P C R 片 段 大 小 接 近全 長 基 因 時 ， 分 離全 長 基 因 并 用 基 外引 物 擴 增 全 長 基 因圖 2 S t E P 重 組 基 本 程 序過渡模板隨機嵌合生長 (random chimeragenesis on transient templates， RACHITT) 過渡模板隨機嵌合生長技術(shù)是與 DNA shuffling概念上明顯不同的、改進的基因家族重組技術(shù)．它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯延伸反應(yīng)，而是將隨機切割的基因片段雜交到一個臨時 DNA模板上進行排序、修剪、空隙填補和連接 。 其中的懸垂切割步驟使短片段 (比 DNase消化片段還短 )得以重組，明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯誤傾向 PCR還可引入額外點突變 。 RACHITT RACHITT Coco等報道此法改造二苯并噻吩單加氧酶，產(chǎn)生的嵌合文庫平均每個基因含 14個交叉，重組水平比 DNA shuffling類方法 (1～ 4個交叉 )高出幾倍；并且可在短至 5 bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉 。 這種高頻率、高密度的交叉水平是 DNAshuffling所難以達到的 。 分子定向進化技術(shù)經(jīng)典實例 —— 頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排 Moxalactam,羥羧氧酰胺頭孢菌素 頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排 ? 首先從四種不同的細菌中分別獲得長度為 酶基因。它們的 DNA同源性很低，從 58%到 82%不等。然后每個基因分別重排，從各自的文庫中選出 50000個克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板。從平板上篩選得到的最好的突變子，它對羥羧氧酰胺頭孢菌素的抗性相對于親本來說大約增加了 8倍。 ? 作為比較，對四個基因進行家族基因重排來構(gòu)造頭孢菌素酶基因的重組文庫。同樣選出 50000個克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板，從中篩選出的最好的克隆子，與抗性較強的親本相比，其抗性增加了 270倍（從 200μg/ml ）；與抗性較弱的親本相比，其抗性增加了 540倍（從 ）。由此可以看出，家族基因重排的效果要比單基因重排好得多。 ? 對家族基因重排中得到的最好克隆子進行進一步研究表明它含有來源于 4個不同親本中 3個親本的 8個片段， 7個交叉的地方都發(fā)生在序列同源的區(qū)域，并且這個最好的克隆子含有高達 33個的點突變。
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