【正文】 素、核苷酸、酶等 疫苗 、 激素 、 單兊隆抗體 、 酶等 植物、動物、微生物細胞的特性比較 141/150 ?植物、動物、微生物細胞之間癿特性差異主要有： 1. 植物細胞 動物細胞 微生物細胞。 2. 動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。 3. 植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。 4. 植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。 5. 植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。 6. 植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。 142/150 二、植物細胞培養(yǎng)癿特點 ? 日本生產(chǎn)紫草寧，含量提高 10倍，比產(chǎn)率提高 830倍。 2. 縮短周期 ? 倍增時間 12—60h，生產(chǎn)周期 1530天。 3. 易于管理，減輕勞動強度 4. 提高產(chǎn)品質(zhì)量 ? 產(chǎn)率高，雜質(zhì)少，產(chǎn)物易于分離提純 5. 對剪切力敏感，生產(chǎn)周期較長，需光照。 143/150 三、植物細胞培養(yǎng)癿工藝條件及其控制 ?工藝流程 144/150 ? 工藝條件控制 1. 溫度癿控制 ? 一般為 25℃ ，溫度高利用生長，溫度低利用產(chǎn)物積累，不低于 20℃ ，不高于 32℃ 2. pH值癿控制 ? 控制在微酸性 ~，培養(yǎng)基 ~ 3. 溶解氧癿調(diào)節(jié)控制 ? 需氧不多，通過通風和攪拌來供給；對剪切力敏感，通風和攪拌不宜劇烈 145/150 ? 工藝條件控制 4. 光照癿控制 ? 據(jù)植物細胞的特性以及目標次級代謝產(chǎn)物不同調(diào)節(jié) 5. 前體癿添加 ? 添加目的代謝物的前體 ? 辣椒胺合成添加苯丙氨酸，或香草酸和異癸酸 6. 刺激劑癿應(yīng)用 ? 刺激劑（ elicitor）可強化次級代謝物和合成，提高產(chǎn)率 ? 如微生物細胞壁碎片和果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶 146/150 四、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶癿過程 ?以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn) 超氧化物歧化酶（ SOD） 為例 SOD具有抗氧化、抗輻射、抗衰老的作用，在消炎，預防衰老，治療癌癥腫瘤的方面都有重要的作用。 147/150 2. 大蒜懸浮細胞培養(yǎng) 1. 大蒜愈傷組織癿誘導 四、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶癿過程 選取大蒜 去皮 70%乙醇 20s %氯化汞 10min 3. 酶癿分離純化 磷酸緩沖液 有機溶劑 MS半固體 培養(yǎng)基 3mg/L 2,4D 溫度 25℃ 光照 600lux 12h/d 時間 18d繼代 一次 篩網(wǎng) 收集細胞 MS液體 培養(yǎng)基 3mg/L 2,4D 6BA 滅菌 玻璃珠 溫度 25℃ 光照 600lux 12h/d 時間 10~12d 時間 18d 消毒 漂洗 無菌水 3次 切塊 誘導 愈傷組織 細胞破碎 震蕩培養(yǎng) 分散細胞 提取沉淀 SOD 單細胞（團） 懸浮培養(yǎng) 148/150 第六節(jié) 動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 動物細胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)： （ 1）疫苗： 脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）疫苗、牲畜口蹄疫苗、風疹疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、黃熱病疫苗、狂犬病疫苗、肝炎疫苗等。 （ 2）激素： 催乳激素、生長激素、前列腺素、促性腺激素、淋巴細胞活素、紅細胞生成素、促濾泡素、胰島素等。 （ 3）多肽生長因子 ：神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、血清擴展因子、表皮生長因子、纖維粘結(jié)素等。 （ 4）酶： 膠原酶、纖溶酶原激活劑（ tPA）、尿激酶等。 （ 5）單克隆抗體： 各種單克隆抗體。 （ 6）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑： 干擾素、白細胞介素、集落刺激因子等。 149/150 一、動物細胞癿特性 （ 1）動物細胞沒有細胞壁，適應(yīng)環(huán)境癿能力差，十分脆弱。 （ 2）動物細胞體積＞微生物細胞，＜植物細胞。對剪切力敏感 150/150 （ 3）在細胞培養(yǎng)中大部分細胞具有 群體效應(yīng) 、 錨地依賴性 、 接觸抑制性以及 功能全能性 。 ? 群體效應(yīng) (Quorum sensing) :菌群數(shù)達到一定的閥值后 , 啟動相應(yīng)一系列基因的調(diào)節(jié)表達 , 以調(diào)節(jié)菌體的群體行為。 ? 錨地依賴性 (Anchorage dependence ):細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂 )。 ? 接觸抑制 (contact inhibition)： 是指細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現(xiàn)象， （ 4）動物細胞癿營養(yǎng)要求較復雜，必須供給各種氨基酸、維生素、激素呾生長因子等。動物細胞培養(yǎng)基中一般需要加迚 5%~10%癿血清 。 151/150 二、動物細胞培養(yǎng)癿特點 （ 1）主要用于各種功能蛋白質(zhì)癿生產(chǎn) ? 疫苗、激素、酶、單兊隆抗體、多肽生長因子等。 （ 2）生長較慢，細胞培養(yǎng)時間 15~100h。 （ 3）需要添加抗生素 。 ? 青霉素 (50~100U/mL)和鏈霉素 (50~100 U/mL)聯(lián)合作用。 ? 添加一定濃度的兩性霉素 (Fungizone)、制霉菌素 (Mycostatin)。 ? 防支原體，采用卡那霉素、金霉素、泰樂菌素等。 152/150 （ 4）動物細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感。 ? 必須嚴格控制溫度、 pH值、滲透壓、通風攪拌等條件。 （ 5）大多數(shù)采用貼壁培養(yǎng)；部分細胞采用懸浮培養(yǎng)。 ? 例如來自血液、淋巴組織的細胞、腫瘤細胞和雜交瘤細胞等。 （ 6）培養(yǎng)基成分較復雜，產(chǎn)物癿分離純化繁雜 ? 一般要添加血清或其代用品 ? 成本較高，適用于高價值藥物的生產(chǎn)。 （ 7）原代細胞繼代培養(yǎng) 50代后，即會退化死亡。 ? 需要重新分離細胞 153/150 三、動物細胞培養(yǎng)癿方式 ?懸浮培養(yǎng) (suspension culture) ?非錨地依賴性細胞，如瘤細胞和雜交瘤細胞等 ?貼壁培養(yǎng) (anchoragedependent） ?存在于淋巴組織以外的組織、器官中的細胞，具有錨地依賴性 ?固定化細胞培養(yǎng) (immobilized cell cultures ) 154/150 1. 懸浮培養(yǎng) (suspension culture) ?適用于非貼壁依賴型細胞 ? 雜交瘤細胞、腫瘤細胞、體液（血液、淋巴液）細胞 ?類似于微生物細胞癿深層収酵，但工藝條件有較大差別 ? 對通氣、攪拌耐受性差 ? 對氧氣的要求較低，需通入一定比例 CO2 ?優(yōu)點（相對于貼壁培養(yǎng)） ? 細胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長情況良好 ? 傳代培養(yǎng)容易，無需消化分散細胞 ? 培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分利用率高 155/150 1. 懸浮培養(yǎng) (suspension culture) 156/150 2. 貼壁培養(yǎng) (anchoragedependent） ?適用于貼壁依賴型細胞 ? 上皮細胞、成纖維細胞 ? 細胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂 蛙上皮細胞 Flog epithelial cells 印度麋鹿皮膚成纖維細胞 Indian Muntjac Deer Skin Fibroblast Cells 157/150 ?滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng) roller bottle culture system ?結(jié)構(gòu)簡單，技術(shù)成熟，重現(xiàn)性好 ?勞動強度大，細胞生長表面積小，產(chǎn)率低 158/150 ?微載體培養(yǎng)系統(tǒng) (microcarrier culture) ?由葡聚糖凝膠（ sephadex） 等聚合物制得的微球 ?比表面積大，單位體積細胞產(chǎn)率高 ?兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢： ?細胞生長環(huán)境均一，營養(yǎng)成分利用率高，重現(xiàn)性好 159/150 3．固定化細胞培養(yǎng) ?錨地依賴性和非錨地依賴性的動物細胞都可以采用 ?一般采用 吸附法 和 包埋法 ?凝膠包埋 固定化、 微膠囊 固定化、 中空纖維 固定化等。 161/150 四、動物細胞培養(yǎng)癿工藝條件及其控制 種質(zhì)細胞 細胞融合 腫瘤細胞 免疫淋巴細胞 懸浮培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 體細胞 雜交腫瘤細胞 分離純化 收集培養(yǎng)液 胰蛋白酶消化 懸浮細胞 篩 選 ?工藝過程 162/150 ?工藝條件控制 1. 溫度癿控制 ?一般控制在 ℃ ，允許溫度波動范圍在 ℃ 之內(nèi)。 ?溫度影響培養(yǎng)基 pH值，溫度降低時，增加 CO2的溶解度，pH值降低。 163/150 2. pH值癿控制 ? pH影響顯著，一般控制在 ~， 。 ? 增加 CO2的濃度，可使 pH值降低 (要考慮溶解氧 )。 ? 添加 NaHCO3溶液，可使 pH值升高 ? pH值的變化較大，流加酸液或堿液 ? pH緩沖系統(tǒng) ? OC2與 NaHCO3系統(tǒng) ? 檸檬酸與檸檬酸鹽系統(tǒng) ? HEPES （羥乙基哌嗪乙烷磺酸 ）：濃度一般為 25 mmol/L ?酚紅指示劑：藍紅： pH ，紅： pH ，橙： ，黃： 164/150 3. 滲透壓癿控制 ? 細胞內(nèi)外的滲透壓處于 等滲狀態(tài) ，一般控制在 700~850 kPa范圍內(nèi)。 4. 溶解氧癿控制 ? 溶解氧至關(guān)重要 ? 供氧不足時，細胞生長受到抑制 ? 氧氣過量時，也會對細胞產(chǎn)生毒害。 ? 根據(jù)具體情況的變化，隨時對溶解氧加以調(diào)節(jié)控制。 ? 調(diào)節(jié)進入反應(yīng)器的 混合氣體的量及其比例 ? 空氣、 O N2和 CO2四種氣體組成，其中 CO2兼有調(diào)節(jié)供氧和調(diào)節(jié)pH值的雙重作用。 165/150 五、動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶癿工藝過程 ?人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn) 組織纖溶酶原活化劑 ? 組織纖溶酶原活化劑是一種 絲氨酸蛋白酶 ，它可以催化纖溶酶原水解，生成纖溶酶。纖溶酶催化血栓中的血纖維蛋白水解，對 血栓性疾病 有顯著療效。 ?組織纖溶酶原激活劑（ tissue plasminogen activator， tPA） ?尿激酶纖溶酶原激活劑（ urokinase plasminogen activator， uPA） ? 1983年，彭尼卡（ Pennica）采用克隆技術(shù)將人的 tPA基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞并得到表達。隨后在多種微生物和動物細胞中表達成功，現(xiàn)已成為銷售量最大的基因工程藥物之一。 166/150 1．人黑色素瘤細胞培養(yǎng)基 ?采用 Eagle培養(yǎng)基 167/150 2．人黑色素瘤細胞培養(yǎng) （ 1）將人黑色素瘤的種質(zhì)細胞用 胰蛋白酶消化處理 ，分散，用 pH 磷酸緩沖液洗滌，計數(shù)，稀釋成 細胞懸浮液 。 （ 2）在消毒好的反應(yīng)器中裝進一定量的培養(yǎng)液，將上述細胞懸浮液接種至反應(yīng)器中，接種濃度為（ 1~3） 103個細胞 /mL，于 37℃ 的 CO2培養(yǎng)箱中，通入含 5% CO2的無菌空氣， 培養(yǎng)至長成單層致密細胞 。 （ 3）傾去培養(yǎng)液，用 pH 洗滌細胞 2~3次。 （ 4）換入一定量的無血清 Eagle培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng) 。 （ 5）每隔 3~4天，取出培養(yǎng)液進行 tPA的 分離純化 。 （ 6）然后再向反應(yīng)器中加入新鮮的無血清 Eag1e培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng) ，以獲得大量 tPA。 168/150 3．組織纖溶酶原活化劑癿分離純化 ? 在獲得的上述培養(yǎng)液中加入一定量的 蛋白酶抑制劑 和 表面活性劑 ，過濾去沉淀，適當稀釋后，采用 親和層析技術(shù) 進行分離（以 tPA抗體為配基，以溴化氫活化的瓊脂糖凝膠為母體制成親和層析劑，上柱、洗滌后用 3mol/L KSCN溶液洗脫，分部收集），得到 tPA溶液。經(jīng)過濃縮、葡聚糖 G150凝膠層析、冷凍干燥得到精制 tPA干粉。 169/150 作業(yè) ?P71思考題