酶工程3酶的分離純化(編輯修改稿)
2025-06-22 22:00 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ， 即能設(shè)計出一組合理的分級分離步驟 。 酶分離純化方法 — 根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 — 根據(jù)溶解度建立的分離純化方法 — 根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法 — 根據(jù)親和作用建立的分離純化方法 — 根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法 ．．．．．． 一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 —— 透析 —— 超過濾 —— 離心 —— 凝膠過濾等。 透 析 (Dialysis)法： 過程 ：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中； 透析袋類型 ：有兩種，再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。有多種型號和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（ ?1?102D）；商品名為 spectrapor等。 透析袋的預(yù)處理 ：干燥的透析袋在制備過程中曾用10%甘油處理過，只要浸泡濕潤和蒸餾水洗滌即可使用；必要時可用 10mmol/L 碳酸氫鈉， 50%乙醇和10mmol/L EDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。 透析袋 酶溶液 蒸餾水 透析裝置和過程 超過濾 利用壓力或離心力強行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。 超濾膜 —— 制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)是截留分子量，耐受壓力和濾速和有效過濾面積等；主要商品型號有 Amicon Diaflo系列等。 超濾器類型 —— 有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。 加壓 酶溶液 超濾膜 支持柵板 超濾液 超濾裝置 離心法 —— 離心是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。 （ 1）離心機的種類和用途 （ 2）沉降系數(shù) S （ 3）離心方法的選擇 差速離心 密度梯度離心 等密度離心 （ 4）離心條件的確定 離心力 離心時間 離心溫度和 pH值 梯度離心 密度梯度 在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大 ,向上逐漸減小 蔗糖 便宜 ， 純度高 ， 濃溶液 （ 60％， w/w） 密度可達(dá) 。 聚蔗糖 的商品名是 Ficoll， 它是由蔗糖和 1 氯 2,3環(huán)氧丙烷合成的高聚物 ， Mr 約 400000。 需要高密度和低滲透壓的梯度時 ， 可用 Ficoll代替蔗糖 。 凝膠過濾法 原理 ：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴展，大于凝膠孔徑的分子不能進入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。 凝膠過濾 凝膠過濾 Tubes march in from left A280 Fraction 部分使用的擔(dān)體 目前使用最廣泛的擔(dān)體材料： ※ 交聯(lián)后的葡聚糖凝膠 ※ 聚丙烯酰胺 ※ 瓊脂 ※ 其它物料 二、根據(jù)溶解度建立的分離方法 鹽析 (Salting Out)法 降低介電常數(shù)法（有機溶劑沉淀 法） 等電點沉淀法 共沉淀法 選擇性沉淀法： 鹽析法 最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為 100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時）。 ? 加入飽和硫酸銨： 100ml溶液中，由飽和度 S1變?yōu)?S2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的 ml數(shù) V= V0（ S1S2） /（ 1S2）。 ? 直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表”。 降低介電常數(shù)法 （有機溶劑沉淀法） 降低介電常數(shù)方法 在酶溶液中加入與水互溶的有機溶劑，可以降低介電常數(shù)，使酶分子間的靜電引力增加而發(fā)生沉淀。 影響介電常數(shù)的主要因素： —— 溫度 —— 有機溶劑 —— 離子強度 —— pH值： 溫度： —— 在 0℃ 下進行操作；有機溶劑必須冷至 15~ 20℃ ，邊攪拌邊緩慢加入，沉淀析出后迅速離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解沉淀。 有機溶劑： —— 常用的有機溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇等 離子強度 —— 大多數(shù)中性鹽在低濃度時能增加酶蛋白的溶解并減少變性，在有機溶劑沉淀中加入 5~10% （ ）的硫酸銨有助于提高分辨率。 pH值 —— 盡可能接近酶的等電點 pI 等電點沉淀法 —— 酶在等電點處容易發(fā)生沉淀 共沉淀法 —— 一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（ PEG） ,聚乙烯亞
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