【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 Key Lab of Medical Geics 堿裂解法 在 NaOH提供的高 pH（ ～ ）條件下，用強(qiáng)陽離子去垢劑 SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體 DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒 DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)用堿處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在回到中性 pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 盡管堿溶液能破壞 DNA中的堿基配對(duì)，但 CCC質(zhì)粒 DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只要不在堿性條件下變性太久，當(dāng) pH調(diào)至中性時(shí)， CCC質(zhì)粒 DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋。 該法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好且成本低，制備的質(zhì)粒純度能滿足 DNA測(cè)序與 PCR等實(shí)驗(yàn)要求，是使用最廣泛的方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對(duì)數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics SDS裂解法 ? SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用 SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒 DNA到等滲液中，然后用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒 DNA ? 由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒 DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 煮沸裂解法 該法條件劇烈，只能用于小質(zhì)粒 DNA的制備 煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含 Triton X100和溶菌酶的緩沖液中， Triton X100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時(shí)可破壞 DNA鏈的堿基配對(duì)，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體 DNA變性，但CCC質(zhì)粒 DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒 DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒 DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 質(zhì)粒 DNA的純化 ? CsClEB法 利用 CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過量 EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。 ? 聚乙二醇沉淀法 （一種分級(jí)沉淀法） ? 柱層析法 （樹脂） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics ? RNA極易被 RNase水解，除胞內(nèi)的 RNase外，它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中； RNase分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能使其完全滅活，而且去除變性劑（ denaturant）后， RNase的活性又可恢復(fù)。 ? 因此，在 RNA的制備過程中，排除 RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是 RNA制備成功與否的關(guān)鍵 真核細(xì)胞 RNA的分離純化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 為獲得完整的 RNA分子，必須在總 RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi) RNase的活性。 ? 選擇性地使用 RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）。 ? 蛋白酶 K和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑如 SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉，并聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如 RNasin與 DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性 RNase對(duì) RNA的降解。 ? 此外，在變性液中加入 β 疏基乙醇、二硫蘇糖醇（ DTT）等還原劑可以還原 RNase中的二硫鍵，有利于 RNase的變性、水解與滅活。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics ? 由 Chomczynski和 Sacchi 于 1987年提出。它以含 4mmol/L的 (異 )硫氰酸胍與 基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，然后在 性條件下，用酚 /氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與 75%的乙醇洗滌來制備 RNA。 。 ? 本法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的 RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，能在 3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本 酸性異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法 分離總 RNA Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics mRNA的分離純化 ? 與序列明確的 rRNA、 tRNA、 snRNA、 scRNA不同，真核生物的 mRNA在細(xì)胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的 mRNA外，絕大多數(shù) mRNA在其 3180。末端帶有長(zhǎng)短不同的 poly（ A）尾巴。 ? 依據(jù) mRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用堿基配對(duì)原則，通過 oligo（ dT） 纖維素或 poly（ U） 瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總 RNA制品中分離純化 mRNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics oligo（ dT） 纖維素柱層析法 oligo（ dT） 纖維素柱離心法 oligo（ dT） 纖維素液相結(jié)合離心法 磁性球珠分離法 該法聯(lián)合利用了 oligo（ dT）與 poly（ A）的互補(bǔ)配對(duì)、生物素（ biotin）與鏈親和素（ streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對(duì) poly（ A） +RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 5180。m7G AAAAAAAAAAAA3 180。 3180。TTTTTTTTTTTTBiotin5180。 + 總 RNA中的 poly(A) +RNA分子 退火形成雜交體 5180。m7G AAAAAAAAAAAA3 180。 3180。TTTTTTTTTTTTBiotin5180。 鏈親和素標(biāo)記的磁珠 + Streptavidin 磁 5180。m7G AAAAAAAAAAAA3 180。 3180。TTTTTTTTTTTTBiotin5180。 Streptavidin 磁 生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合 磁性分離 5180。m7G AAAAAAAAAAAA3 180。 磁鐵 3180。TTTTTTTTTTTTBiotin5180。 Streptavidin 磁 洗滌與洗脫 水相 (含純化的 mRNA) 固相 生物素標(biāo)記的 oligo(dT) 磁鐵 5180。m7G AAAAAAAAAAAA3 180。 3180。TTTTTTTTTTTTBiotin5180。 Streptavidin 磁 圖 32 磁珠分離法純化 poly(A) +RNA的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 其它方法 Poly(U)凝膠層析法 : 利用 Poly(U)與 Poly(A)的互補(bǔ)配對(duì)原理 Poly(U)濾紙法 : 將總 RNA加到共價(jià)交聯(lián)有Poly(U)的濾紙上 ,經(jīng)洗滌后加熱洗脫 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚