【正文】 濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。 凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同 “ 過篩 ” 一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 離子交換層析的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 電 泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為電泳(elctrophoresis) 。 電泳 (elctrophoresis) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSpolyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）：常用于蛋白質(zhì)分 子量的測定。 每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的 SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，E?q值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 等電聚焦電泳（ isoelectric focusing， IEF） 通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 雙向凝膠電泳 twodimensional electrophoresis Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 方法 原理 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 凝膠層析 分子篩的排阻效應(yīng) 分辨力高、不會(huì)引起變性 凝膠介質(zhì)昂貴、處理量有限 離子交換層析 各組份與離子交換劑親和力不同 分辨力高、處理量較大 需酸堿處理樹脂、操作耗時(shí) 電泳法 等電點(diǎn)、分子量、電荷的差異 分辨力很高、可連續(xù)制備 儀器試劑昂貴 鹽析法 破壞水化膜和中和表面電荷 操作簡便、成本低、重復(fù)性好、對蛋白有保護(hù)作用 分辨率差、純化倍數(shù)低、沉淀中混雜鹽分 選擇性沉淀 等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用 選擇性較強(qiáng)、方法簡便、種類較多 應(yīng)用范圍較窄 有機(jī)溶劑沉淀 脫水作用和降低介電常數(shù) 操作簡便、分辨較強(qiáng) 對蛋白質(zhì)或酶有變性作用 親和層析 蛋白質(zhì)與配體之間特殊的親和力 分辨力很高 局限性大 高速與超速離心 沉降系數(shù)或密度差異 操作方便、容量大 設(shè)備昂貴 制備 HPLC 凝膠過濾、離子交換、反向色譜等 分辯力很高、步驟少， 儀器昂貴 常用的蛋白質(zhì)分離純化方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的分離純化往往要采取多種方法聯(lián)合使用，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，逐步地制備高純度或高比活的靶蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離純化的目標(biāo) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 蛋白質(zhì)樣品的純度鑒定 ? 蛋白質(zhì)的純度（ purity）一般指是否含有其它雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、 SDS等小分子在內(nèi)，一定條件下的相對均一性。目前常用的鑒定純度的方法有：有聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）、 SDSPAGE、毛細(xì)管電泳（ CE）、等電聚焦電泳（ IFE）及高效液相色譜（ HPLC）。此外，還有超速離心法、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)分析法。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 蛋白質(zhì)的定量和分子量測定 ? 蛋白質(zhì)的定量，通常是指測定溶液中的蛋白質(zhì)濃度。測定蛋白質(zhì)總量的方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，此法雖有普遍性，但操作繁瑣，目前極少使用。 ? 應(yīng)用較為廣泛的方法是雙縮脲法、福林 酚法和紫外吸收法。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics ? 測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特異性的生物學(xué)方法?；钚缘臏y定和總蛋白量的測定配合起來可以用來表示分離純化過程中某一特定靶蛋白的純化程度。純化程度常用這一特定成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（質(zhì)量單位）之比來表示。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics ? 確定了蛋白質(zhì)的均一性后，蛋白質(zhì)的定性以及一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，都需要測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量以及亞基和寡聚體的分子質(zhì)量。測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法很多，這此方法都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)來測定分子量的，由此測得的分子量稱為物理分子質(zhì)量。與物理分子量相對應(yīng)的是化學(xué)分子量，化學(xué)分子量是從化學(xué)分析所得的結(jié)果，計(jì)算而得到的最小分子質(zhì)量。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 四、生物小分子的提取純化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 溶劑提取法 水蒸氣蒸餾法 升華法 超臨界流體萃取法 超聲提取法 固相萃取法 常用提取方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 分離精制的原理主要是根據(jù)： 1）物質(zhì)溶解度差別； 2）物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同； 3)物質(zhì)的吸附性差別； 4）物質(zhì)分子大小差異等進(jìn)行分離 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics 常用純化方法 逆流分配法（ CCD） 液滴逆流色譜法（ DCCC） 高速逆流色譜法（ HSCCC） 氣液分配色譜（ GC或 GLC） 液 液分配色譜 凝膠過濾法 超濾法 硅膠吸附色譜 氧化鋁吸附色譜 大孔吸附樹脂吸附色譜 等 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics Metabolite Regulation of Glycolysis and Gluconeogenesis Glucose G6P F6P F16P2 Glucokinase PEP Pyruvate Lactate + H+ ADP ATP Pyruvate kinase Oxaloacetate GTP GDP ATP CO2 ADP Pyruvate carboxylase CO2 PEPcarboxy kinase AcetylCoA + F16P2 + ATP, Alanine _ ATP ADP F6P 1 kinase Citrate, ATP, H+ _ AMP, F26P2 + Fructose1,6bisphosphatase AMP, F26P2 _ ADP ATP Pi Glucose6phosphatase Glucokinase binding protein (F6Pligated) _ (FBPase) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geics TState RState