酶的分離與純化ppt課件-資料下載頁
2025-01-05 20:17本頁面
【正文】 根據(jù)支持介質(zhì)的不同 ， 又可分為濾紙電泳 ， 醋酸纖維素薄膜電泳 ， 瓊脂糖凝膠電泳以及聚丙烯酰胺凝膠電泳等 。 ? 根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一 ， 分為連續(xù)電泳 ， 不連續(xù)電泳 。 連續(xù)電泳：整個(gè)電泳系統(tǒng)使用相同的支持介質(zhì)和緩沖液 。 不連續(xù)電泳：電泳系統(tǒng)使用不同的支持介質(zhì) （ 包括凝膠的濃度與孔徑等 ） 和不同的緩沖液 （ 包括緩沖液的組成與 pH等 ） 。 常用電泳技術(shù) ? 醋酸纖維素薄膜電泳 醋酸纖維素是將纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。 該薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附性小 ， 又因膜的親水性小 ，它所容納的緩沖液也少 ， 電泳時(shí)電流的大部分由樣品傳導(dǎo) ，所以分離速度快 ， 電泳時(shí)間短 ， 樣品用量少 ， 特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè) 。 醋酸纖維素薄膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后，可使膜透明化有利于對(duì)電泳圖譜的光吸收掃描、測(cè)定和膜的長(zhǎng)期保存。 過程：膜預(yù)處理 加樣 電泳 染色 脫色與透明 檢測(cè) ? 瓊脂糖凝膠電泳 用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳 。 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖 ， 占瓊脂含量的 80%， 是一種優(yōu)良的電泳材料 ， 廣泛用于同工酶 ， 血漿脂蛋白分離 ， 也可用于免疫電泳 。 ? 聚丙烯酰 胺 凝膠電泳 1） 聚丙烯酰胺凝膠的聚合：聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰氨 （ Acr） 和甲叉雙丙烯酰胺 （ BIS） 通過化學(xué)催化或光催化聚合成三維立體空間的多聚物 。 化學(xué)聚合的催化劑常用過硫酸銨 。 為加速反應(yīng) ， 需加 TEMED四甲基乙二胺作為加速劑 。 催化反應(yīng)需堿性環(huán)境 ， 如 pH為 ， 丙烯酰胺的濃度為 7%， 30min就可聚合完畢 。 2）聚丙烯酰胺凝膠 的孔徑與機(jī)械強(qiáng)度 聚丙烯酰胺凝膠 的 分離效果與凝膠孔徑有關(guān) ， 凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定 。 凝膠總濃度 T（ g/dl） 表示 100ml凝膠中丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的總克數(shù) 。 T值越大 ， 孔徑越小 。 交聯(lián)度 C表示交聯(lián)劑 BIS占凝膠總濃度 T的百分比 。 C值越大 ， 孔徑越小 。 3） 聚丙烯酰胺凝膠的高分辯率主要?dú)w結(jié)于以下 3種效應(yīng) （ 1） 濃縮效應(yīng)：導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品被壓縮為一個(gè)薄層 。 （ 2） 分子篩效應(yīng)：凝膠有一定的孔徑 ， 不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)受到不同的阻力 。 小分子受到的阻力小 ， 跑在前面；大分子受到的阻力大 ， 跑在后面 。 （ 3） 電荷效應(yīng) ? SDS— PAGE電泳 SDS又叫十二烷基硫酸納 ， 是一種陰離子表面活性劑 ， 能使蛋白質(zhì)分子帶上大量 SDS陰離子 （ 負(fù)電荷 ） ， 大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷 ， 從而掩蓋了各種蛋白質(zhì)原有的電荷差異 （ 可近似認(rèn)為各種蛋白質(zhì)分子帶電荷相等 ） 。 因此 ， 蛋白質(zhì)的電泳遷移率僅僅反映了各蛋白質(zhì)分子量的差別 。 分子小 ， 電泳時(shí)跑得快 ， 分子大 ， 電泳時(shí)跑得慢 ， 因而能將分子量不同的蛋白質(zhì)分開 。 SDS— PAGE是 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的最好方法 。 四、酶的濃縮（ concentration） ? 蒸發(fā) ? 膠過濾 ? 超濾 ? 反復(fù)凍融 ? PEG濃縮 ? 凍干 凍干機(jī) 五、酶的結(jié)晶（ crystallization） 第四章 思考題 細(xì)胞破碎的方法有哪些 ？ 簡(jiǎn)述其特點(diǎn) 。 發(fā)酵液預(yù)處理的目的？主要去除哪些物質(zhì)？ 鹽溶、鹽析、雙水相萃取法、超臨界流體萃取法、膜分離、透析、超濾 酶提取中涉及哪些技術(shù)方法 ？ 鹽析法的機(jī)制？ 鹽析法常用中性鹽？ 鹽析法最常用的無機(jī)鹽是什么 ？ 有何優(yōu)缺點(diǎn) ？ 哪些因素影響其鹽析效果 ？簡(jiǎn)述鹽析的基本操作過程 。 有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理？有何優(yōu)缺點(diǎn)？常用的有機(jī)溶劑？ 比較膜分離技術(shù)特點(diǎn)。在酶分離純化中常用哪些膜分離技術(shù)？ 在酶的分離純化中，凝膠過濾法用途有哪些？ 1簡(jiǎn)述離子交換技術(shù)基本過程。 1比較凝膠過濾、離子交換、吸附層析、親和層析工作原理。 1聚丙烯酰胺凝膠電泳具高分辨率原因？ 1目前測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的最好方法？簡(jiǎn)述工作原理。 1酶濃縮的常用方法？ 1 查閱一篇酶分離純化與酶學(xué)特性研究的綜述或研究性文章 。
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