核酸分離純化技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-01 01:09本頁(yè)面
【正文】 料及試劑 ? RNA酶的水的配制 ? 在三蒸水中加入 %DEPC， 37℃ 放置12~16小時(shí)，高壓滅菌 30分鐘，去除殘留的 DEPC。 ? ? 使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，釋放 RNA。 ? 4 mol/L 異硫氰酸胍 ? 25 mmol/L 檸檬酸鈉 ? % 十二烷基肌氨酸鈉 ? mol/L β－巰基乙醇 ? 10%十二烷基肌氨酸鈉 ? 3. 2 mol/L NaAc（ ） ? 為沉淀 RNA提供 Na＋。 ? （ ） ? 抽提 RNA。 ? 操作方法 ? 組織細(xì)胞的勻漿、變性 ? 離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用 PBS緩沖液洗滌， 4 000r/min離心 10分鐘，去除 PBS緩沖液，重復(fù) 3次，加入變性液振蕩至細(xì)胞裂解，液體變黏稠。 ? RNA抽提 ? 在上述裂解液中，加入 1/10倍體積的 2mol/L NaAc、等體積的水飽和酚、 1/5體積的氯仿 ∶ 異戊醇（ 49∶ 1）（每加一種試劑后均應(yīng)充分振蕩混勻），置冰浴 15分鐘， 4℃ 、 12 000r/min離心 20分鐘，小心吸出上清，注意不要吸出富含蛋白質(zhì)和 DNA的中間界面。再加等體積的酚及 1/5體積的氯仿 ∶ 異戊醇（ 49∶ 1），顛倒混勻， 4℃ 、12 000r/min離心 20分鐘，小心吸取上清。 ? 沉淀 RNA ? 加入等體積的異丙醇，－ 20℃ 沉淀 1～ 2h。4℃ 、 12 000r/min離心 20分鐘，棄上清，沉淀用 ，重新混懸至沉淀完全溶解。加等體積異丙醇，混勻，－ 20℃ 1～2h， 4℃ 、 12 000r/min離心 20分鐘，棄上清，用預(yù)冷的 75％酒精洗滌沉淀 1～ 2次，將沉淀于室溫晾干，溶于無(wú) RNA酶的水中。 ? 原理 ? 與蛋白質(zhì)分子類(lèi)似， DNA分子也是兩性電離分子。在 ～ ，堿基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離， DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。但不同大小和構(gòu)象的 DNA分子的電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，遷移率區(qū)別很小，難以分開(kāi)。采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，發(fā)揮其 分子篩效應(yīng) ，則可使分子大小和構(gòu)象不同的 DNA分子遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離目的。 瓊脂糖凝膠 電泳 ? 電泳后經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外光照射下DNA顯橙紅色熒光，可直接觀察判斷結(jié)果或照像。 ? DNA在凝膠中的遷移率與它的分子量的對(duì)數(shù)成反比，若將未知 DNA的遷移距離與已知分子大小的 DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離相比較，可以計(jì)算出未知 DNA片段的大小。 ? 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。 ? 濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。 瓊脂糖濃度 (%) 線型 DNA分子的分離范圍(Kb) 5～ 60 1～ 20 ～ 10 ～ 7 ～ 6 ～ 3 ～ 2 儀器 – 電泳儀 – 電泳槽 – 灌膠模具等 儀器和試劑 –Tris硼酸（ TBE） Tris乙酸（ TAE） Tris磷酸（ TPE） 常用電泳緩沖液 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖 400組成上樣緩沖液。 作用： ①增加樣品比重，以確保 DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。 ②形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。 ③使樣品呈色，使加樣操作更方便。 上樣緩沖液 溴化乙錠（ EB） 是一種熒光染料， EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與 DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品 DNA濃度。 瓊脂糖凝膠 EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其 DNA量一般5ng， EB的使用的終濃度為 。 核酸染色劑 注意事項(xiàng)： EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 不同種類(lèi)DNA Marker 制備 1%瓊脂糖凝膠。稱(chēng)取適量瓊脂糖加入 20mL TBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至 5060℃ 時(shí)，加入 EB 至終濃度 。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。 取 10181。l DNA樣液與 2181。l 上樣 buffer 混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。 接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為 1~5V/cm（長(zhǎng)度以?xún)蓚€(gè)電極之間的距離計(jì)算） ,待溴酚蘭移動(dòng)到一定位置，停止電泳。 四、操作步驟
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